Opticki, piezo i kalorimetrijski biosenzori - PowerPoint PPT Presentation

Title: Opticki, piezo i kalorimetrijski biosenzori


1
Opticki, piezo i kalorimetrijski biosenzori
BH
2
OPTICKI BIOSENZORI

• Oblast biosenzora koji koriste opticku detekciju
  jako je razvijena poslednjih godina uglavnom zbog
  prednosti optickih sistema
• Osnova ovih sistema su enzimske reacije koje
  menjaju opticke osobine nekih supstanci i na taj
  nacin im omogucavaju da emituju svetlost pri
  osvetljvanju (ekscitaciji)
• Nacini opticke detekcije obuhvataju
  fluorescencu, fosforescencu, hemi/bioluminiscencij
  u

3

• Prednosti optickih biosenzora obuhvataju
• moguca je minimizacija upotrebnom optickih
  vlakana
• moguca su in situ merenja
• moguca su in vivo merenja
• diodna merenja omogucavaju multi-analiticku
  detekciju
• signal ne ometaju elektromegnetne interferencije

4

• Mane optickih biosenzora su
• ambijenata svetlost jako smeta
• opticka vlakna su vrlo skupa
• indikator faza može biti spran tokom vremena

5

• Opticka vlakna su subklasa optickih talasovoda
  koji rade na principu totalne unutrašnje
  refleksije
• Svetlost koja je pala na medupovršinu izmedu dve
  dielektricne sredine bice ili reflektovana ili
  reflektovana prema Snells Law ovom zakonu

6
A
Prevlaka
Jezgro
B
B
Totalna unutrašnja refleksija
7

• Ako svetlost ude u opticko vlakno (okruženo
  sredinom manjeg indeksa prelamanja) pod dovoljno
  malim uglom svetlost ce se zadržati unutar vlakna
• Zbog toga se opticko vlakno sastoji od jezgra
  visokog indeksa prelamanja, okruženog prevlakom
  nešto nižeg indeksa prelamanja, a celo vlakno je
  zašticeno neoptickim omotacem

8
Omotac
qmax
Prevlaka
Jezgro
Prevlaka
Omotac
9

• Ulazna svetlost, a samim tim i izlazna zavise od
  precnika vlakana
• Kako se za fleksibilna vlakna, zahteva veoma
  mali precnik, ova velicina je ogranicavajuci
  faktor u proizvodnji vlakana
• Zbog toga se vlakna prave od snopova koji imaju
  prednost efikasnog skupljanja svetlosti i
  fleksibilnost
• Na tržištu se mogu naci, snopovi od 8, 16 i
  više vlakana.

10

• Generalno biosenzori bazirani na optickim
  vlaknima koriste fluorescenciju ili
  hemiluminiscenciju
• Ovo se bazira na cinjenici da je fluorescencija
  bitno osetljivija od apsorbance
• Ovakvo baziran biosenzor je mnogo feksibilniji
  zbog cinjenice da je poznato da veliki broj
  analita i faktora menjaju emisiju odgovarajucih
  fluorofora

11

• U osnovi postoje dve razlicite konfiguracije
  koje se koriste na vrhu sonde optickog vlakana
• konfiguracija distalne kivete
• konfiguracija vezanih talasovoda

12

• Konfiguracija distalne kivet obuhvata detekciju
  imobilizovanog molekula u poriznoj transparentnoj
  sredini na vrhu vlakna
• Fluorescencija se manja kada analit difunduje i
  kada je vezan
• Ekscitacija dolazi izvan vlakan i emisija se
  kupluje u vlaknu

13
Sonda na optickom vlaknu
Molekul koji se detektuje
Analit
14

• Tip konfiguracije sa vezivajucim talasovodom
  obuhvata vezivanje detektorskih molekula, sa
  obeleženim fluorescentnim (npr. antitela), sa
  kovalentno pricvršcenim molekulima analita na
  površinu vlakna
• Pošto je obeleživac blizu površine on se
  ekscituje prolaznim talasom koji se emitije iz
  vlakna, a rezultujuca fluorescencija se kupluje u
  vlakno
• Slobodni analit se takmici za vezivajuca mesta
  molekula za prepoznavanje, omogucujuci im da
  difunduju dalje od površine što za rezultat ima
  smanjenje fluorescence

15

Obeleženi fluorescent koji prepoznaje molekul
Slobodni antigen
Imobilisani analit
16

• PIEZOELEKTRICNI PRETVATRAC
• Princip ovog tipa senzora se bazira na
  otkrivanju, postoji li linearan odnos izmedu
  promene u frakvenciji oscilovanja
  piezoelektricnog (PZ) kristala i varijacije mase
  na njegovoj površini
• Sauerbrey je 1959. god. otkrio da je promena
  mase obrnuto proporcionalna promeni frekvencije
  rezonirajuceg kristala (obicno na MHz).

17

• ?F -2.3x106F2DM/A (Sauerbrey jednacina)
• Promena u masi se odigrava kada analit
  specificno interaguje sa bispecificnim agensom
  koji je imobilizovan na površini kristala
• Kristal može biti prevucen antitelima, enzimima
  ili organskim materijalom
• Mogu se meriti promene frakvancije manje od
  1MHz cime se postiže nanogramska osetljivost

18
Tanak kvarc
Au
Elektricni kontakt
19

• SAW PRETVARACI
• Surface acoustic wave (SAW). Uredaji sa
  akusticnim talasima sa površine rade na principu
  prostiranja akustoelektricnih talasa bilo duž
  površine kristala bilo kroz kombinaciju celokupne
  zapremine i površine.
• Oscilacija kristala u SAW uredajima je veca ,
  bar za faktor 10 od oscilacije kristala koji se
  koriste u PZ uredajima

20

• KALORIMETRIJSKI PRETVARACI
• Enzimom katalizovane reakcije pokazuju istu
  promenu entalpije kao spontane hemijske reakcije
• Primeceno je znatno oslobadanje toplote (5-100
  kJ/mol).
• Zbog toga su kalorimetrijski pretvaraci
  univerzalno primenjivi u enzimskim reakcijama

21

• Konstruisani termicki senzori baziraju se na
• direktnim pricvršcivanjem imobilizovanog enzima
  ili celije na termistor.
• -imobilizacija enzima je u koloni u koji je
  termistor umetnut
• ?T n?H/cp

22
Enzim Substrat -DH
(kJ/mol) Katalaze Vodonik peroksid 100.4 Hole
sterol oksidaza Holesterol 52.9 Glukoza
oksidaza Glukoza 80.0 Heksokinaza
Glukoza 27.6 Laktik dehidrogenaza
Piruruvat 62.1 ?- Laktamaza Penicilin
G 67.0 Ureaza Urea 6.6 Urikaza Urinska
kiselina 49.1
23
Veza/Pojacivac
Pisac
Uzorak
Termistor
Struja pufera
Enzimski reaktor
Izmenjivac toplote
Poliuretanska izolacija
Aluminijumski blok
24
Unutrašnji Al blok
Indikatorski termister
MB reaktor 1 ml
Referentni termister
Spoljašnja izolacija
Izmenjivac toplote
25

• NANOSENZOR
• Opticki nano senzor koji služi za in-vivo
  analizu u jednoj celiji
• -vrh sonde ima precnik od 40-50 nm
• -kraj izolacije na optickom vlaknu ima precnik
• 200 nm
• -specificno antitelo je imobilisano na vrhu
• -nanometarska velicina obezbeduje blisko polje
  ekscitacije

26
-koristi se za odredivanje toksicnih hemikalija
(npr. bezo(?)piren tetrola (BPT) i benzo(?
)pirena (BaP) -linija na 325 nm iz HeCd lasera
služi za ekcitaciju BPT i BaP -invertni
mikroskop služi za kontrolu postavljanja sonde u
pojedinacnu celiju Fluorescentna svetlost se
fokusira objektivom mikroskopa i šalje na brojac
fotona (fotomultiplikator PMT)
27
Vrh nanosenzora
Nanosenzor u celiji
28

• -nanostruktura je dovoljno mala da bi se locirao
  unutar subcelijskih struktura (jezgro,
  mitohondrije)
• -mala struktura nanosenzora omogucava da se
  smesti unutar tipicne celije sisara a da ne
  nacini nikakvu štetu
• -nakon unošenja nnosenzora u pojedinacnu celiju
  ona može nastaviti svoje rutinske funkcije kao
  što je mitoza
• -moguce je detektovati samo nekoliko molekula
  BPT u pojedinacnoj celiji

29
Shematski prikaz aparture za primenu nanosenzora
30
(No Transcript)
31

• -nisko magnetno polje omogucava da se merenje
• izvede unutar same celije sa neznatnom
• pozadinom (pozadinski šum)
• -odlicna osetljivost i reproduktivnost
• -odreduju se pikomolarne koncentracije u
• jednoj celiji
• -tipicno inkubaciono vreme u celiji je pet minuta