Erlihiozes un ercu encefalita izsauceju - PowerPoint PPT Presentation

Title: Erlihiozes un ercu encefalita izsauceju


1
Erlihiozes un ercu encefalita izsauceju
molekulara biologija (Projekts LU13 ,
2003.g.) Projekta vaditaji Prof. V.Baumanis -
LU Biologijas fakultate
Prof. A.Žilevica - LU Medicinas
fakultate Izpilditaji R.Ranka
- PhD stud.biol.
A.Bormane - PhD stud.biol.
A.Zeltina - stud. pharm.
L.Timša - stud.
biol.bac. V.Škipars
- stud. biol.bac.
K.Salmina - mag.biol.
I. Zeltina - PhD stud.med.
RSU Konsultanti V.Sondore - Dr.med., Valsts
Infektologijas centrs B.
Rozentale - Dr.med., Valsts Infektologijas
centrs,RSU A.Duks
- Dr.med., Sabiedribas Veselibas agentura
2
Saslimšanas gadijumu skaits ar ercu encefalitu
Z-Eiropa un Krievijas ZR dala
Latvija 2003.g. - 365 saslimšanas gadijumi, t.i.,
15,66 gadijumi uz 100 000 iedzivotaju
3
Petijumu aktualitate Saslimstiba
Latvija Kur ir labak Kur ir sliktak
(uz 100.000 iedzivotajiem) Ercu encefalits
12,8 0,01(Norv) 15,8 (Est)
Erlichioze ?
? Zinams vienigi,ka

Zviedrija ap 5

ercu inficetas Laima
borelioze 11,5 3,1(Norv)
46,3 (Lt) Babezioze ?
? Vacija 1,9 ercu

inficets
Riketsiozes ? ?
Vacija 9 ercu

inficets Wollbachias
? ?
Vacija 1 ercu

inficets Koksiellozes
? ? ? (Q
drudzis)
4
Petijumu merki 1.
Izstradat mineto infekciju molekularas
detektešanas metodes uz polimerazes kedes
reakcijas pamata,jo a) ercu encefalita
virusu (TBEV), ka ari erlihijas ir gruti
kultivet b) lai noteiktu ercu
inficetibas pakapi , nepieciešmi salidzinoši
dati, kas ieguti ar dažadam metodem 2.
Veikt mineto infekciju molekularo tipešanu
a) epidemiologiskiem petijumiem b)
mikroorganismu celmu dažadas patogenitates
analizei, jo piemeram, ercu
encefalits (TBE) raksturojas ar loti dažadu
klinisko formu smagumu, kuru
celons nav zinams c) mikroorganismu
evolucijas prognozešanai d) terapijas
un profilakses pasakumu izstradašanai - vai ir
atbilstiba starp Latvija lietoto
vakcinu virusu genotipiem un ercu virusiem 3.
Meginat raksturot viremijas intensitati un ilgumu
, salidzinot to ar TBE kliniskas formas
smagumu
5
TBEV subtipu izplatiba Eirazija

• Rietumu subtips- parnesa I.ricinus (dzeltens)
  - letalitate 0,5 - 2
• Talo Austrumu subtips- parnesa I.persulcatus
  (sarkans) - letalitate 1 - 4
• sastopami abi subtipi (oranžs)

6
TBE diagnosticešanas metodes

• Tiešas
• (virusa noteikšana)
• RT- PCR
• Elektronmikroskopija
• Virusu kultivešana

• Netiešas
• (antivielu noteikšana)
• ELISA
• Immunoblotešana
• Hemaglutinacijas inhibicijas tests (HIT)
• Virusu neitralizacijas tests (NT)
• Komplementa fiksacijas reakcija (CFR)

7
TBEV struktura

• Sastav no tris strukturalajiem proteiniem
• E- apvalka glikoproteins
• (imunogenais)
• M- membranas glikoproteins
• C- kapsidas proteins

8
Ercu encefalita virusa genoms un
ta tipešana Vienpavediena RNS , dažadiem celmiem
10.927-11.141 nukleotidu gara, kode 3 strukturas
proteinus V1(M) - kopa ar E proteinu
piedalas apvalka veidošana V2(C) - core
proteins V3(E) - apvalka proteins,
glikoproteins, ar hemaglutinina ipašibam,
šis antigens induce neitralizejošo
antivielu biosintezi 7 nestrukturalie
proteini NS1, NS2A, NS3, NS4A, NS4B, NS5, tie
sintezejas ka poliproteins, kurš velak
saškelas, funkcijas nezinamas
Detektešanai izmanto 5- terminala
gala nekodejoša rajona 128 nukleotidu garu
fragmentu Detektešanai un tipešanai
izmanto NS5 proteina kodejoša rajona
252 nukleotidu garu fragmentu
9
Darba shema

• Ercu materiala savakšana
• Kliniska materiala izvele
• TBE virusa RNS izolešana (fenola - hloroforma
  metode vai QIAamp Viral Mini Kit)
• Erlihiju nukleinskabes izolešana - fenola -
  hloroforma metode
• Erlihiju DNS fragmentu PCR amplifikacija
• TBEV cDNS sinteze (reversa transkripcija)
• Rezultatu analize 2,5 agarozes gela vai 8 PAAG
• Atsevišku amplikonu skvenešana

10
Metodes jutibas noteikšana TBEV 5'NCR rajona
RT-PCR amplifikacijas produktu elektroforetiska
analize 8 PAAG gela
1. celinš - DNS garuma markieris 2., 3., 4., 5.,
6., 7., 8., 9. celini - ercu encefalita K23
celma antigena (Encepur vakcina) atškaidijumi,
solis - 10x 6. celinš - robežatškaidijums, 9,8 fg
TBE virusa RNS 10. celinš - negativa kontrole
184bp 124bp
1 2 3 4 5 6 7 8
9 10
Sekvenešanas rezultati pieradija amplikonu
specifiskumu
11
TBE virusa nekodejoša rajona (5NCR) fragmenta
RT-PCR (reverse transcription - polymerase chain
reaction) metodes jutiba tika noteikta 9,8 fg TBE
virusa RNS TBE virusa NS5 gena fragmenta
RT-PCR metode uzradija zemaku jutibu - apmeram
900 fg TBE virusa RNS
12
TBE virusa detektešana erces I
TBEV 5'NCR rajona RT-PCR amplifikacijas produktu
elektroforetiska analize 2,5 agarozes gela.
3., 4. celinš- Encepur vakcina (172 bp) 5.celinš-
Krievija ražota TBE vakcina 2.celinš- negativa
kontrole 1.celinš- DNS garuma markieris

• 1., 5., 7., 8.celinš- PCR produkti no
  neinficetam ercem
• 2., 3., 4., 6.celinš- PCR produkti no inficetam
  ercem
• 11.celinš - DNS garuma markieris,
• 10.celinš- pozitiva kontrole
• 9.celinš- negativa kontrole

13
TBE virusa detektešana erces II
TBEV NS5 gena fragmentu RT-PCR amplifikacijas
produktu elektroforetiska analize 8 PAAG gela.

• 1.celinš- pozitiva kontrole (252 bp)
• 2.celinš- DNS garuma markieris
• 3.celinš- negativa kontrole
• 5.celinš- PCR produkts no inficetam ercem
• 6., 7.celinš- PCR produkti no neinficetam ercem.

14
TBEV detektešana erces III

• Tika analizeti 12 ercu grupu (60 erces, pa 5
  viena grupa) un 22 individualu ercu paraugi, RNS
  izolešanai izmantoja fenola-hloroforma metodi
• no 22 individualajam ercem, kas bija piesukušas
  cilvekiem, 17 iepriekš bija noteiktas TBEV
  pozitivas ar ELISA metodi, ar 5NCR fragmenta
  RT-PCR metodi pozitivu rezultatu deva 1 paraugs
  (glabati paraugu lizati)
• ar 5NCR fragmenta RT-PCR metodi TBEV pozitivas
  bija 7 no 12 daba savakto ercu grupam (11)
• ar NS5 gena fragmenta RT-PCR metodi TBEV
  pozitivas bija 3 no 12 daba savakto ercu grupam
  (5)

15
Sabiedribas veselibas agenturas dati
(2003.g. - 6,7)
(2003.g. 18)

16
Ar TBEV 5NCR fragmenta RT-PCR metodi tika
analizeti 13 TBE slimnieku asins plazmas paraugi,
virusa RNS izolešanai tika izmantots QiAamp Viral
Mini-kits Paraugi bija nemti no dažadiem
slimniekiem, un visos paraugos iepriekš ar ELISA
metodi bija apstiprinata specifisko antivielu
pret TBEV klatbutne, antivielu titrs paraugiem
bija dažads Ar TBEV 5NCR fragmenta RT-PCR
metodi visi 13 asins plazmas paraugi uzradija
negativu rezultatu
TBEV detektešana asins plazmas paraugos
17
Erlihiju taksonomisko raksturojumu megina
precizet pec 16S rRNS secibas
18
Erlihiju detektešanai izmantotais
16S rRNSgena fragments
19
Polimerazes kedes reakcijas dati rada, ka
erlihijas Latvijas erces ir
20
Secinajumi

• RT-PCR metode ir perspektiva TBE virusa
  detektešanai ercu materiala, nakotne ši metode
  varetu sniegt iespeju diferencet dažados TBE
  virusa subtipus
• Izveletas RT-PCR metodes jutiba ir pietiekoši
  liela, tacu tas pielietošanu ierobežo neskaidra
  viremijas aina TBE slimniekiem un RNS
  nestabilitate
• Pirmoreiz Latvija ar molekularam metodem
  pieradita ercu inficetiba ar erlihijam

21
Neatrisinatie jautajumi

• Vai viremija TBE gadijumos ir vai nav noverojama
  un ja ir, tad
• a) kura slimibas stadija to novero
• b) vai viremijai ir kada saistiba
  ar antivielu titru
• c) vai viruss nesorbejas uz
  eritrocitiem
• Kadu sugu erces , to attistibas stadijas biežak
  noverojama to inficetiba ar TBEV un erliijam
• Kada genotipu TBEV un erlihiju variabilitate
  sastopama Latvija
• Vai ir kada sakariba starp TBEV genotipu un TBE
  kliniskas formas smagumu
• Vai cilveki Latvija ar erlihiozem neslimo, vai
  tas vienkarši netiek atklatas
• Kuri genu produkti ir mikroorganismu
  patogenitates faktori un kuri genu produkti
  izraisa neitralizejošo antivielu vai šunu
  imunitates atbildi
• Makroorganisma nozime mineto infekciju gaita
• Ka evolucione mikroorganismu genetiskie tipi

22
Publikacijas, disertaciju darbi un uzstašanas
par projekta rezultatiem 1. R.Ranka, A.Zeltina ,
A.Bormane, I.Zeltina.Ercu encefalita virusa
detektešana ar molekularas biologijas metodem -
Latvijas Universitates 62. Zinatniska konference
, 2004.g. 2. Bormane A., Lucenko I., Duks A.,
Mavchoutko V., Ranka R., Salmina K., Baumanis V.
Vectors of tick-borne diseases and
epidemiological situation in Latvia in 1993-2002.
International Journal of Medical Microbiology.
2003, v.293, 36-47. 3. R.Ranka. Ercu izraisito
infekciju - laima slimibas un encefalita
molekulara diagnostika. Disertacija aizstaveta
2004.g.2.junija 4. A.Bormane. Ixodes ercu un to
parnesato patogenu petijumi. Pašreiz norit
eksperimentala materiala vakšana disertacijai
(aizstavešana tiek planota uz 2005-6.g.) 5.
Bormane A., Ranka R., Salmina K., Lucenko I .
Natural foci of tick-borne diseases and
epidemiological situation in Latvia during the
last decade. VII International Simposium on
Tick-borne diseases, Berlin, 2003 6. R.Ranka,
A.Bormane, V.Baumanis. Molecular studies on
tick-born disease causing agents in Latvia.
Abstracts of 29th FEBS Congress. Warsaw, Poland,
June 26-30,2004 (accepted).
23
Saskarsme ar citiem petniecibas projektiem
LZP projekts 02.0924 - Latvija sastopamo
Borrellia sugu un Borrelia burgdorferi tipu
molekulari genetiska izpete
Iesniegts projekts EC 6. Satvaram EDEN -
Tick-born diseases.
Koordinators S.E.Randolf , Oxford University,
UK. Ka lidzdalibnieki
ir 13 valstis Iesniegts
projekts EC 6. Satvaram PatoGenoMics.
Koordinators W.Diekmann
(Vacija) Ka
lidzdalibnieki 8 valstis