An

1
Análisis de la OTAUn aspecto importante de los
programas de prevención contra la OTA

• Módulo 6.2

2
Por qué hacer un análisis de la OTA

• En apoyo a los programas de vigilancia de la OTA
• Para generar datos sobre los niveles de
  distribución y contaminación
• Para permitir la evaluación de las repercusiones
  de las medidas de prevención y optimizar los
  programas
• Para certificar el cumplimiento de los niveles
  oficiales de OTA o de los requisitos del
  comprador
• En apoyo a la investigación orientada a entender
  mejor el problema y probar soluciones

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Planificación del análisis de la OTA

• Para realizar los beneficios del análisis de la
  OTA, los servicios analíticos deben tener
• La competencia técnica y el equipo necesarios
  para llevar a cabo los análisis requeridos con
  los niveles de sensibilidad y cuantificación
  pertinentes
• La capacidad de llevar a cabo el volumen de
  análisis necesarios en el plazo requerido

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Inversión en el análisis de la OTA

• Instalaciones adecuadas
• Para reducir al mínimo los peligros
  profesionales asegurar un entorno para que el
  equipo funcione bien y reciba el mantenimiento
  necesario t
• Equipo y materiales necesarios
• Para llevar a cabo los estudios y los métodos
  oficiales de análisis según se requiera
• Personal adecuado y calificado
• Analistas profesionales y expertos técnicos para
  mantener y reparar el equipo personal de apoyo
  capacitación regular en el trabajo

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Son aceptables los costos?

• Promueve la confianza en el sector nacional del
  café
• Los programas oficiales de vigilancia y análisis
  de la OTA, cuya buena cimentación esté
  comprobada, pueden promover la confianza de los
  importadores y la posición del país en el
  comercio internacional
• Protege a los consumidores del país
• Protege contra el riesgo de que café de poca
  calidad se destine al consumo local
• Recuperación de costos de la industria
• Es posible recuperar por lo menos una parte de
  los costos

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Aspectos técnicos de los programas de análisis de
la OTA

• Los principales aspectos de los programas de
  análisis de la OTA son
• Los planes de muestreo
• Métodos de análisis validados
• Un sistema para garantizar la calidad

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Planes de muestreo para investigar la presencia
de OTA en el café

• La distribución heterogénea de OTA en los lotes
  de café hace necesario tomar muestras
  representativas
• Los planes de muestreo se deben diseñar en
  relación con el objetivo de la toma de muestras
• Para tener una unidad representativa a fin de
  estimar el todo
• Para caracterizar un determinado sector de la
  población
• La formulación de planes oficiales de muestreo
  tiene como objetivo proporcionar métodos
  internacionales para evitar dificultades surgidas
  de diferencias jurídicas y técnicas relacionadas
  con la toma de muestras en el comercio (Codex
  Alimentarius)

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Establecimiento de métodos de muestreo

• Los métodos de muestreo para los programas de
  vigilancia y análisis de la OTA deben especificar
• Procedimientos para la toma y la manipulación de
  las muestras
• El tamaño y el número de incrementos para obtener
  una muestra representativa
• Criterios estadísticos para la aceptación y el
  rechazo de un lote, a partir de la muestra

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Aspectos decisivos del muestreo para el análisis
oficial de la OTA

• El tamaño de la muestra y el número de muestras
  significan
• El porcentaje de lotes aceptados a
  concentraciones inferiores al límite reglamentado
  (lotes buenos)
• El porcentaje de lotes rechazados a
  concentraciones superiores al límite reglamentado
  (lotes malos)
• Incertidumbre asociada con el procedimiento de
  análisis de la OTA
• Riesgos de los compradores
• Riesgos de los vendedores

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Requisitos para los métodos oficiales de análisis

• Validación
• Precisión
• Posibilidad de repetir los resultados (en y entre
  laboratorios)
• En el margen de criterios de desempeño mínimo
  establecidos

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Características principales de los métodos
oficiales de análisis

• Exactitud
• Aplicabilidad
• Límites de detección y determinación
• Linealidad
• Precisión
• Recuperación
• Selectividad
• Sensibilidad

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Quién decide en los métodos oficiales de
análisis?

• Los métodos validados pueden adoptarse como
  métodos oficiales por
• El Codex Alimentarius
• AOAC International
• Normas nacionales e internacionales

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Selección de métodos cuando no hay métodos
oficiales o no son aplicables

• Validación interna, de acuerdo a las
  Recomendaciones armonizadas de la IUPAC para la
  validación de métodos de análisis en un solo
  laboratorio
• Método comprendido en la norma ISO/IEC 170251999
  o principios de buenas prácticas de laboratorio

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Métodos oficiales

• Métodos internacionalmente validados en
  colaboración mediante protocolos internacionales
  armonizados
• Café tostado, Entwisle et al. 2001 AOAC
  2000.09 CEN EN 141322003 
• Café verde, Vargas et al. 2005 AOAC 2004.10
• En el sitio web de la AOAC no se ha anunciado
  algún método oficial de análisis de la ocratoxina
  A

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Diagrama de circulación del análisis de la OTA
Diagrama de los pasos generales de la toma de
muestras, preparación de las muestras y análisis
de la presencia de micotoxinas en los productos
agrícolas
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Evaluación de los métodos de análisis de la OTA

• Hay criterios funcionales importantes
• Exactitud y posibilidad de repetición
• Hay consideraciones prácticas significativas
• Velocidad del análisis
• Cualitativo o cuantitativo
• Preparación necesaria para hacer el ensayo
• Costos iniciales y recurrentes

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Pasos del análisis de la OTA preparación de las
muestras

• Es un paso de primera importancia en el
  procedimiento analítico
• Requiere tiempo

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Pasos del análisis de la OTA la extracción

• El solvente específico depende de la matriz o de
  los pasos de purificación y cuantificación

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Pasos del análisis de la OTA la extracción

• Recuperación de la verdadera concentración de las
  micotoxinas es un punto crítico

Solvente orgánico en presencia de ácido o un
solvente de extracción que contenga bicarbonato
de sodio acuoso
Batidora o mezcladora de alta velocidad
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Pasos del análisis de la OTA purificación

• Supone en esencia
• Separar la micotoxina de las sustancias que se
  extrajeron con ella
• Paso inicial de la concentración
• Métodos de purificación
• Los procedimientos comunes requieren tiempo y son
  laboriosos
• Inmunoafinidad con sorbentes para extracción de
  fase sólida (EFS)
• Un importante método
• Proporciona métodos muy selectivos

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Pasos del análisis de la OTA purificación

• Columna de inmunoafinidad en la purificación del
  café verde

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Pasos del análisis de la OTA separación,
detección y cuantificación

• Los métodos disponibles son
• Cromatografía de líquidos con detector de
  fluorescencia (CL/fluoresencia)
• Cromatografía en capas delgadas (CCD)
• Prueba de inmunosorción enzimática (ELISA)
• Fluorimetría
• Dispositivos de flujo lateral
• Inmunoensayo de polarización de fluorescencia
  (FPIA)

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Pasos del análisis de la OTA separación,
detección y cuantificación

• Nuevos enfoques analíticos
• Métodos de análisis rápidos y económicos
• Basados en biosensores
• Kits de tiras reactivas
• Cromatografía de líquidos aunada a
• Espectrometría de masas por ionización de haz de
  electrones (MS)
• Espectrometría de masas en tandem o secuencias
  (MS/MS)

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La cromatografía de líquidos en el análisis de
la OTA

• Principales ventajas
• Posibilidad de automatización
• Poder de separación
• Selectividad
• Límites más bajos de detección (0,12-0,2 ?g/kg)
• Principales desventajas
• Método costoso
• Requiere analistas y técnicos calificados

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La cromatografía de líquidos en el análisis de
la OTA
Detección y cuantificación
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La cromatografía en capas delgadas en elanálisis
de la OTA
Técnica robusta, sencilla, veloz, económica
Principales ventajas
Relativamente económica considerable
competencia y experiencia en los países en
desarrollo utilizada en aplicaciones de rutina
Columna de inmunoafinidad

• Extractos de muestras libres de interferencias
  mayores de la matriz
• adecuada para el análisis dimensional de CCD
• mejora la sensibilidad, separación, resolución y
  visualización

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La cromatografía en capas delgadas en elanálisis
de la OTA

• Confirmación de la presencia de OTA a través de
  la CCD
• Rociar las láminas de ccd con cloruro de aluminio
  y bicarbonato de sodio
• Exponer las placas a vapor de amonio
• Se ha confirmado la CCD en FI como método para la
  detección de OTA en el café

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La cromatografía en capas delgadas en elanálisis
de la OTA

• Principales desventajas de la CCD
• Costo elevado de los fluorodensitómetros
  comerciales
• La cuantificación sigue siendo una limitación
• Habilidad de los analistas para cuantificar
  visualmente la toxina
• Falta de resolución
• Poca sensibilidad

29
La cromatografía en capas delgadas en elanálisis
de la OTA
30
Métodos de detección para el análisis de la OTA

• Principales ventajas
• Métodos rápidos de prueba
• Fáciles de usar
• El análisis se puede llevar a cabo sobre el
  terreno

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Métodos de detección para el análisis de la OTA

• Limitaciones
• Respuesta cualitativa sí o no hay contaminación
• Resultados negativos falsos
• Necesidad de confirmación de los resultados
  positivos
• Desventajas
• Elevado costo recurrente
• Falta de atención respecto a la condición de la
  extracción de las muestras
• Tendencia a no tener en cuenta los requisitos de
  las muestras

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Métodos de detección para el análisis de la OTA
Kits de análisis para detección en el café
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El método ELISA en el análisis de la OTA
Popular y útil instrumento de detección gracias a
la disponibilidad de anticueros policlonales y
monoclonales contra la OTA

• Ventajas del sistema ELISA
• Sencillez
• Número de muestras que se pueden analizar al
  mismo tiempo

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El método ELISA en el análisis de la OTA

• Desventajas del sistema ELISA
• Menos exacto y sensible
• Se encontraron muy pocas correlaciones
  (tradicionales)
• Resultados positivos o negativos falsos
• No se debe usar como método cuantitativo
• Sólo se debe usar con alimentos en los que se ha
  experimentado ampliamente y cuya eficacia se ha
  demostrado
• En cada prueba deben utilizarse suficientes
  controles

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Métodos de espectrofluorimetría para el análisis
de la OTA

• Suponen
• Utilizar columnas de inmunoafinidad con
  fluorómetro
• Principales desventajas
• Tasas mayores de resultados positivos y negativos
  falsos

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Garantía de calidad del análisis de la OTA

• Garantía de calidad analítica
• Son esenciales programas para garantizar
  resultados fidedignos
• Donde se requiere aceptabilidad internacional, es
  importante la acreditación
• Se proporciona orientación detallada sobre
  garantía de calidad analítica para el análisis de
  la OTA en la sección de documentación de apoyo
  del módulo 5.2 de este CD-Rom