C

1
Cílená lécba nádorových onemocnení fikce, nebo
nadeje?
Karel Ulbrich Ústav makromolekulární chemie AV
CR, v.v.i.
2
Obsah prednášky

• Úvod do problematiky polymeru ve farmacii a
  polymerních léciv
• Polymerní léciva - konjugáty polymeru a
  nízkomolekulárních léciv, polymerní
  kancerostatika
• Využití poznatku pri dalších aplikacích - vektory
  pro genové terapie, diagnostika
• Záver a výhledy

3
Co muže zlepšit použití syntetických polymeru pri
príprave léciv a lékových forem?
Klasické nízkomolekulární lécivo
Polymerní formy léciv
Opakované dávkování v relativne krátkých casových
intervalech, vedlejší a casto toxické úcinky, v
rade prípadu malá úcinnost lécby
Potreba jedné nebo jen nekolika dávek, malá
spotreba léciva, minimalizace vedlejších úcinku,
úcinnejší lécba
4

• Paul Ehrlich, 1908 Magic Bullet první
  predstava o cílne pusobícím lécivu
• Helmut Ringsdorf, 1976 model polymerního
  léciva
• Jindrich Kopecek 1978 model polymerních
  konjugátu s rízeným uvolnením léciva

Jindrich Kopecek
5
Požadavky na ideální lécivo

• Léková forma, ve které je lécivo neaktivní, bez
  jakéhokoliv vlivu na organizmus (bunky imunitního
  systému, neukládá se v játrech, není vylouceno
  ledvinami)
• v této forme je specificky dopraveno do místa
  požadovaného úcinku (orgán, tkán, bunka)
• aktivuje se pouze v míste požadovaného úcinku,
  pusobí v požadované koncentraci
• pusobí po dobu optimální pro dosažení maximálního
  lécebného úcinku
• lécivo, metabolity a všechny komponenty
  nosicového systému jsou po dosažení efektu
  eliminovány z organizmu

6
Návrh struktur vyhovujících postulovaným
požadavkum

• Syntéza knihoven látek o ruzné strukture a
  pomocí screeningových metod provést výber
• Pochopení vztahu mezi strukturou a vlastnostmi
  polymerních systému použít pro návrhy struktur
  na míru pripravovaných polymerních léciv

7
Schéma klasického polymerního léciva
Biodegradovatelná spojka (oligopeptid,
hydrolyticky štepitelná spojka)
Lécivo (model)
Smerující struktura sacharid, lektin, protilátka
(IgG a fragmenty), hormon, specifický oligopeptid
8
Multivalentní HPMA kopolymery používané pro
syntézu polymerních konjugátu (príklad
nejpoužívanejších struktur)Príprava klasickou a
nebo rízenou (RAFT) radikálovou polymerizací
C
H
C
H
3
3
C
H
C
C
H
C
2
2
C
O
C
O
b
x
N
H
C
H
2
C
H
O
H
C
H
3
R-CO
NH2
SH
9
Protilátkou smerované polymerní lécivo - hreben
Protilátkou smerované polymerní lécivo - hvezdice
Polymerní lécivo
Reaktivní prekurzor
Polymerní lécivo roubovaná struktura
Polymerní lécivo s kombinovaným úcinkem
Polymerní micelární lécivo
Polymerem modifikovaný virus pro genovou terapii
Polymerní lécivo s kombinovaným úcinkem dve
léciva
10
Fyzikální a chemická struktura syntetických
polymeru
Lineární a vetvená struktura
Polymer retezec molekul (monomeru )
složený do makromolekuly
Roubovaná struktura
polymerní sít
hvezdicová struktura
Kopolymery a terpolymery
11
Vodorozpustné polymerní konjugáty s lécivy
12
Možnosti uvolnování léciva z polymerního nosice
(b)
(c)
(a)

1. Uvolnení v krevním recišti
2. Uvolnení ve tkáni po extravazaci
3. Specifické uvolnení v cílových bunkách po
   endocytose

Cévy
Cévy
13
Hlavní požadavky kladené na polymerní nosice
léciv

• Stabilita v prubehu transportu - chemická vazba
  léciva na nosic
• Rízené uvolnení léciva z nosice (chemická
  hydrolýza, enzymolýza)
• Cílený transport k nádoru, nádorovým bunkám
  (pasivní smerování pomocí EPR efektu, aktivní
  smerování smerující strukturou
• Eliminace nosice z organizmu (degradovatelný
  nosic, micelární nosic)

14
Schéma klasického konjugátu poly(HPMA) s
kancerostatikem doxorubicin (PK1) (enzymatická
aktivace léciva)
Enzymaticky degradovatelný oligopeptid
-GlyPheLeuGly-
Místo enzymatického štepení
15
Schéma hydrazonového konjugátu poly(HPMA) s
kancerostatikem doxorubicin (pH závislá
hydrolytická aktivace léciva)
Jednoduchá vazba nebo spacer
Místo hydrolytického štepení
16
Hlavní požadavky kladené na polymerní nosice
léciv

• Stabilita v prubehu transportu (chemická vazba
  léciva na nosic)
• Rízené uvolnení léciva z nosice (chemická
  hydrolýza, enzymolýza)
• Cílený transport k nádoru, nádorovým bunkám
  (pasivní smerování pomocí EPR efektu, aktivní
  smerování smerující strukturou
• Eliminace nosice z organizmu (degradovatelný
  nosic, micelární nosic)

17
Princip enzymaticky rízeného uvolnování léciva z
polymerního nosice uvnitr cílové bunky
Polymer
Spojka (oligopeptid)
Gly-Phe-Leu-Gly---
DOX
Model léciva, lécivo (DOX)
Substrát (oligopeptid)
S1
S3
S4
S2
S3
S1
S2
Aktivní místo enzymu (proteázy)
ENZYM
18
Uvolnování DOX z polymeru pri inkubaci
PHPMA-X-DOX konjugátu se smesí lysosomálních
enzymu - tritosomu
STRUKTURA UVOLNENÉHO DOXORUBICINU V SÉRU UVOLNENÉHO DOXORUBICINU V SÉRU UVOLNENÉHO DOXORUBICINU V SÉRU
STRUKTURA 3 h 6 h 24 h
-GFLG- 0.7 0.8 1.9
-GLFG- 0.5 0.5 1.5
-GG- 0 0.1 0.2
19
Uvolnování DOX z hydrazonových polymeru
inkubovaných ve fosfátových pufrech o ruzném pH
modelující prostredí v krvi (7.4) a uvnitr bunek
(5.5)
pH 5.5
pH 7.4
20
Hlavní požadavky kladené na polymerní nosice
léciv

• Stabilita v prubehu transportu (chemická vazba
  léciva na nosic)
• Rízené uvolnení léciva z nosice (chemická
  hydrolýza, enzymolýza)
• Cílený transport k nádoru, nádorovým bunkám
  (pasivní smerování pomocí EPR efektu, aktivní
  smerování smerující strukturou)
• Eliminace nosice z organizmu (degradovatelný
  nosic, micelární nosic)

21
Princip pasivního smerování akumulace polymeru
v pevných nádorech (EPR efekt) (H. Maeda a kol.)
Nádorová tkán
Normální tkán
Málo propustný endothel
Porézní kapilární systém
Fungující lymfatický systém
Tesné kapiláry nebo chybející lymfatický systém
22
Biodistribuce poly(HPMA) nosice v myši s B16F10
melanomem. Vliv Mw na distribuci.
Biodistribuce poly(HPMA) nosice (Mw 60 kDa) v
kryse s prostatickým AT1 nádorem, závislost na
case.
23
Konjugáty umožnující pasivní smerování do pevných
nádoru
Nedegradovatelné polymerní lécivo (limit Mw 50
000 g/mol)
Micelární polymerní lécivo
Biodegradovatelné vysokomolekulární polymerní
lécivo dendritické struktury
Biodegradovatelné vysokomolekulární roubované
polymerní lécivo
24
Struktura micelárního PHPMA-DOX konjugátu
(s cholesterolem a pH-rízeným uvolnováním DOX)
Vodné prostredí
Mw(pol) 32 kDa I 1.8 Mw(mic) 170 kDa DOX
7 wt cholesteryl 3.5 mol dmic 22 nm
25
Syntéza roubovaných konjugátu s rízeným
uvolnováním Dox a rízenou biodegradací


26
Hypervetvená polymerní léciva na bázi dendrimeru
DOX

Semitelechelický HPMA kopolymer
Jednoduché dendritické jádro
PAMAM dendrimery
G1
Mw80 000 - 150000 In1.8 to 2.3 Rh8 - 10.5 nm
G2
Mw120 000 - 250000 In2.0 to 2.6 Rh10 - 14 nm
27
Uvolnení Dox z micelárního a roubovaného nosice
na bázi HPMA kopolymeru, fosfátový pufr o pH 5
(nebo pH 5,5) a 7.4 , 37 C
pH 5.5
pH 7.4
28
Eliminace polymerních léciv z krevního recište a
akumulace do nádoru u B/6 myší nesoucích myší
lymfom EL4. Porovnání s volným lécivem.
Akumulace v nádoru
Eliminace z obehu
Akumulace modelu léciva DY-676 na lineárním (Mw
30 KDa) a HMW hvezdicovém polymerním nosici
sledované u nu-nu myši (HT-29 colon carcinoma) 49
h po injekci (konfokální laserová fluorescencní
mikroskopie)
29
Aktivní smerování internalizace polymerních
léciv v bunkách Uvolnení léciva (a) hydrolýza v
endosomech, (b) enzymolýza v sekundárních
lysosomech
lysosom
primární endosom pH 5 - 6
Jádro
sekundární lysosom, pH 5, enzymy
30
Schéma klasického protilátkou smerovaného
konjugátu doxorubicinu (enzymatická aktivace)
150 kDa
31
Schéma hvezdicového protilátkou smerovaného
konjugátu doxorubicinu (enzymatická aktivace)
S-CH2CH2-CO------TT
X
DOX
32
Smerování polymerních léciv pomocí cástí
protilátky (scFv fragment), vazba pomocí
komplexu proteinu BTX-BTXbp
Smerování polymerních léciv pomocí cástí
protilátky (scFv fragment), vazba pomocí
komplexu proteinu BTX-BTXbp
scFv-BTX pripravený metodami genového
inženýrství (University of Oxford)
Dox-PHPMA-BTXbp
Dox-PHPMA-BTXbp
30 kDa
scFv anti-PSMA, M 75 Ab (karb. anhydráza),
33
Smerování polymerních léciv pomocí cástí
protilátky (scFv fragment), vazba pomocí
komplexu proteinu BTX-BTXbp
Smerování polymerních léciv pomocí cástí
protilátky (scFv fragment), vazba pomocí
komplexu proteinu BTX-BTXbp
scFv-BTX pripravený metodami genového
inženýrství (University of Oxford)
Dox-PHPMA-BTXbp
Dox-PHPMA-BTXbp
H-GSGGSGGTGYRSWRYYESSLEPYPD-OH
H-GSGGSGGTGYRSWRYYESSLEPYPD-OH
34
Hlavní požadavky kladené na polymerní nosice
léciv

• Stabilita v prubehu transportu (chemická vazba
  léciva na nosic)
• Rízené uvolnení léciva z nosice (chemická
  hydrolýza, enzymolýza)
• Cílený transport k nádoru, nádorovým bunkám
  (pasivní smerování pomocí EPR efektu, aktivní
  smerování smerující strukturou
• Odstranení nosice z organizmu (degradovatelný
  nosic, micelární nosic)

35
Schéma degradace roubovaného konjugátu
(degradace v reduktivním prostredí bunky)
Degradace v cílové bunce
Vysokomolekulární lécivo s akumulací v pevném
nádoru
Nížemolekulární fragmenty vyloucitelné z organizmu
36
Degradace roubovaného PHPMA konjugátu se spojkou
GFLG po inkubaci s kathepsinem B c(kathepsin B)
5.10-7 mol/l
Degradace roubovaného PHPMA konjugátu se spojkou
-S-S- po inkubaci s glutathionem c(glutathion)
3.10-6 mol/l
Vylucovací mez polymeru ledvinami
37
Degradace polymerního dendritického léciva v
pufru modelujícím prostredí uvnitr bunky
Velikost klubka ve fosfátovém pufru s NaCl (DLS)
Reduktivní degradace c(glutathionu) 3.10-3 mol/l
aqueous GPC, detection LS (Wyatt tech.) and
RI column Superose 6TM, mobil phase acetate
buffer pH 6.5
DLS measurement PBS pH 5.5
38
Protinádorová aktivita polymerních léciv
studovaná na modelových nádorech u myší (rust
nádoru, doba prežití, váha) Výsledky testu
provádených na MBÚ AV CR. (a) In vitro testy (b)
In vivo testy terapeutický režim aplikace
léciva in vivo ( první aplikace po vytvorení
nádoru, nejcasteji po 8 11 dnech od inokulace)
39
Smerované PHPMA-DOX konjugáty, výsledky in vivo
testu (Balb/c myši, BCL1 leukemie i.p., lécba
i.v.), terapeutický režim podání a) jedna dávka
5mg/kg, (hv 11 den) b) dve dávky 11 a 14 den,
2x5mg/kg (kl)
40
Lécba C3H/HeN myší s 38C13 lymfomem (1x105, s.c.)
doxorubicinem (5x2.5 mg/kg) nebo polymer-DOX
konjugáty (ekvivalent 5 mg/kg DOX) aplikovanými
8 a 11 den (terapeutický režim podání)
41
Ptotilátkami smerované polymerní konjugáty
kancerostatik

• Výhody vysoká úcinnost lécby, jsou úcinné i pri
  nízkých koncentracích
• Nevýhody jsou velmi specifické, není snadná
  príprava ve vetším množství a je drahá, nepusobí
  obecne na více typu onemocnení

42
Lineární konjugáty PHPMA-DOX s hydrazonovou
vazbou výsledky in vivo testu, nesmerovaný
lineární konjugát - terapeutický režim
podání Myší T-bunecný lymfom EL4, myši C57BL/6,
lécba i.p. 10 nebo 10 a 20 den
Hydrolyticky štepitelná vazba, pH závislá
rychlost štepení
43
Vysokomolekulární roubované polymerní konjugáty
DOX (Hydrazon) In vivo protinádorová aktivita
105 bunek T-bunecného lymfomu EL4 inokulovaných
myším B/6 v den 0. Lécba den 11. i.v. ,
jednoduchá dávka 15 mg DOX ekv./kg
A konjugát s enzymatickou degradací B
konjugát s reduktivní degradací
44
Vysokomolekulární micelární konjugáty
PHPMA-DOX Doba prežití B/6 myší s inokulovaným
EL-4 T-bunecným lymfomem (s.c.) lécených 8 (a
príp. 12) den po inokulaci jednou nebo dvema
dávkami léciva
45
Lécba dendritickým a roubovaným lécivem, EL4
T-bunecný lymfom, lécba 9 den po inokulaci
Dávka 15 mg DOX eq./kg
Dávka 10 mg DOX eq./kg
Polymerní konjugát (Mw 260 000, In 1.9, DOX
10.2 wt.)
46
Konjugáty PHPMA-DOX smerované scFv fragmentem
anti-PSMA protilátky.Vazba DOX pres GFLG
oligopeptid, scFv fragment anti-PSMA protilátky.
Nádor prostaty PC346C v athymických myších. Dávka
2 x 0.05 mg DOXekv/kg.
scFv
R. Willemsen, Erasmus Centre, Rotterdam
47
Maximální tolerovaná dávka léciva PHPMA-DOX v
myších
48
Prežití B/6 myší vylécených od EL-4 lymfomu a
retransplantovaných novou smrtelnou dávkou
nádorových bunek EL 4 lymfomu (105)
Micelární konjugáty lišící se strukturou
hydrofobního jádra
Hvezdicové konjugáty lišící se strukturou
degradovatelné spojky (enzymaticky ci reduktivne
štepitelné)
49
Využití poznatku z vývoje rozpustných polymerních
konjugátu v diagnostice a genové terapii
50
Konjugát gadolinia pro diagnostiku (angiografii)
magnetickou resonancí
Hmotová spektroskopie (5.190.28) váh.
Gd Kontrastní látka 0.5 M (78 mg/ml
Gd) Komplex je stabilní (neuvolnuje Gd)
minimálne po dobu 2 mesícu inkubace
C
H
C
H
3
3
C
H
C
C
H
C
2
2
C
O
C
O
N
H
N
H
C
H
C
H
2
2
H
C
O
H
C
H
2
C
H
C
H
3
2
C
H
2
C
H
2
C
O
N
H
MW 24.8 kDa Mw/Mn 1.92
H
C
C
H
C
O
N
H
C
H
C
O
O
H
2
C
O
C
H
2
N
H
C
O
O
H
H
C
C
H
C
O
O
H
Gd
2
C
O
O
H
51
MR-Angiografie u krysy, porovnání komplexu
poly(HPMA)-Gd s Gd-DTPA, 1.5 T MR scanner 0.02
mmol/kg
poly(HPMA)-Gd
Magnevist firmy Schering

Krebsforschunginstitut Heidelberg
52
MRI zobrazení krysy, pohled z brišní strany,
ruzná hloubka zobrazení
Univerzita Olomouc
53
Syntetické polymery jako soucást vektoru pro
genovou terapii
54
Genová terapie

• moderní lécebná technika založená na doprave DNA
  nebo specifického
• genu do cílové bunky pacienta za úcelem opravy ci
  náhrady
• poškozeného genu, inhibice replikace genu a nebo
  vyvolání geneticky podmíneného zániku celé bunky
• Gen
• specifická cást molekuly DNA (urcená presným
  poradím nukleotidu) schopná replikace, která nese
  samostatnou jednotku genetické informace
• Vektor genové informace
• prenašec genetické informace schopný dopravit gen
  do cílové bunky, nebo až do bunecného jádra
  (vektory jsou nevirální syntetické a nebo
  virální, adenoviry a retroviry).

55
Požadavky na vektory pro dopravu genu úcinné v in
vivo podmínkách

1. Stabilita v krevním recišti, minimální interakce
   s bunkami imunitního systému
2. Extravazace do cílové tkáne
3. Interakce s receptory cílových bunek
4. Endocytoza
5. Únik z endosomu do cytoplasmy
6. Transport k bunecnému jádru
7. Úcinná transfekce, transdukce a produkce
   aktivního proteinu

56
Rekombinantní adenovir potenciální vektor pro
nádorovou genovou terapii
Požadavky na intravenozní aplikaci

• Virus se nesmí vázat na erythrocyty a neutrofily
• Nesmí napadat makrofágy a bunky RES
• Nesmí docházet k neutralizaci protilátkami a
  komplementem
• Nesmí docházet k záchytu viru v jaterních bunkách
• Musí být schopen specifického smerování k
  vybraným bunkám (retargeting)

Receptory coxsackie a adenovirus receptory
(CAR), receptory pro fibre knob ligandy
57
Povrchová modifikace viru hydrofilním polymerem
Reaktivní esterová skupina
Aminoskupina

Semitelechelický monovalentní polymer
PEK, Virus

Klasický multivalentní polymer se smerující
skupinou
Rekombinantní adenovirus nesoucí specifický gen
58
Osud povrchove modifikovaného viru v cílové bunce
Prostredí v bunce
Extracelární prostredí
Ochranný polymer
adenovirová kapsida
Presmerovaný virus
endosom
pH lt 6 GSH
Smerující struktura
Uvolnení DNA
Degradovatelné vazby
Bunecná membrána
59
Príklad HPMA kopolymeru urcených pro povrchovou
úpravu virálních nosicu genu
C
H
C
H
C
H
C
H
3
3
3
3
C
H
C
C
H
C
C
H
C
C
H
C
2
2
2
2
C
O
C
O
C
O
C
O
N
H
O
N
H
N
H
C
H
(
C
H
)
(
C
H
)
(
C
H
)
2
2
2
2
2
2
2
C
H
O
H
N
C
H
C
H
N
H
N
H
3
3
C
l
C
H
C
H
C
O
C
O
3
3
(
C
H
)
(
C
H
)
2
2
2
2
S
Reduktivne štepitelná vazba (v cytoplasme)
S
S
S
(
C
H
)
(
C
H
)
2
2
2
2
C
O
C
O
N
EGF
S
S
60
Modifikace viru kopolymerem HPMA obsahujícím
smerující skupinu
Nemodifikovaný virus
Polymerem modifikovaný virus
61
Polymerem modifikovaný nesmerovaný adenovirus
Ad5-GFP ztrácí schopnost úcinne infikovat bunky
(A549 plicní nádor), pripojením smerující
struktury se aktivita specificky obnoví
Polymerem modifikovaný virus
Virus retargetovaný pomocí bFGF
Nemodifikovaný virus
Asociace s bunkami (FACS)
Transgenní exprese genu
Ad5-GFP
62
Exprese polymerem modifikovaného viru Ad5-GFP
smerovaného humanizovanou protilátkou herceptinem
SKOV3 Ovariální nádor
PHPMA modi-fikovaný virus
Herceptinem retargetovaný virus
Bunky
Virus
63
Smerování adenoviru jako vektoru genové informace
pomocí scFv specifických protilátek
scFv
scFv
scFv
Ad-PHPMA-BTXbp
H-GSGGSGGTGYRSWRYYESSLEPYPD-OH
64

• ZÁVERY.
• Vodorozpustné polymerní nosice léciv na bázi
  kopolymeru HPMA predstavují významnou alternativu
  pri vývoji pasivne i aktivne smerovaných
  kancerostatik.
• Polymerní cytostatika mají minimální vedlejší
  úcinky, nepoškozují imunitní systém jako klasická
  cytostatika a vykazují, na rozdíl od klasické
  chemoterapie, krome výrazne zlepšeného
  chemoterapeutického efektu i efekt
  imunostimulacní. Tento efekt se uplatnuje u
  ruzných typu nádoru (u myší i u lidských
  pacientu).
• Polymerní nosicové systémy mají širokou škálu
  použití i v jiných oblastech medicíny, napr. v
  diagnostice (MR zobrazení) a pri vývoji systému
  pro genovou terapii.

65
Podekování spolupracovníkum

• Týmu pracovníku oddelení biolékarských polymeru
  ÚMCH AV CR
• Týmu Prof. Blanky Ríhové, MBÚ AV CR
• Týmu Prof. Lena Seymoura, University of Oxford,
  UK
• Kolegum na University of Halle (Prof. K. Mader)
• Akademii ved CR za financní podporu výzkumu
  (Akademická prémie)