Identificazione%20dei%20microrganismi

1
Identificazione dei microrganismi

• esame microscopico diretto del materiale in esame
• Caratteristiche morfologiche
• Colorazione di Gram
• Colorazione di Ziehl-Neelsen
• Caratteristiche colturali
• Caratteristiche biochimiche
• Tipizzazione fagica
• Caratteristiche antigeniche (Diagnosi
  sierologica)
• Antibiogramma

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Paziente (sospetta malattia infettiva)
Via immunologica
Prelievo di sangue
Via microbiologica
Ricerca di anticorpi contro il sospetto patogeno
Sangue Feci Urine Biopsia
Prove sierologiche (RIA, ELISA)
Microbiologia tradizionale
Microbiologia innovativa
Biologia molecolare (ricerca del genoma del
patogeno)
Immunologia (ricerca del patogeno batteri o
virus)
Coltura in un terreno selettivo
Immunofluorescenza ELISA
DNA-probes PCR
Isolamento
Identificazione Prove selettive
Identificazione immunologica
Sensibilità agli antibiotici (decisione sulla
chemioterapia)
3
Diagnosi sierologica di infezione batterica
DIRETTA ricerca di proteine o altri componenti
(antigeni) del microrganismo A tale scopo devono
essere disponibili sieri iperimmuni o anticorpi
monoclonali che reagiscono specificamente solo
con il patogeno che si ricerca. La disponibilità
di sieri iperimmuni e di anticorpi monoclonali,
specifici per i vari antigeni presenti sul corpo
batterico (antigeni dei flagelli H, dei pili F,
delle strutture pilo- simili K/F, della capsula
K, della parete cellulare O), permette di
eseguire prove immunologiche specifiche adatte a
identificare con precisione un microrganismo. IND
IRETTA ricerca di anticorpi specifici per il
batterio dinteresse
4
Metodi diretti

• Identificazione con sieri iperimmuni o anticorpi
  monoclonali
• Agglutinazione
• ELISA
• Immunofluorescenza IFA

5
Metodi indiretti

• Fissazione del complemento
• Agglutinazione
• Precipitazione
• ELISA
• Immunofluorescenza IFA
• Western blot

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Scelta del metodo diagnostico

• DIAGNOSI DIRETTA maggiore specificità ma
• DIAGNOSI INDIRETTA generalmente meno costosa, e
  più accessibile
• La scelta dipende da
• FASE DELLA MALATTIA
• Il batterio o gli anticorpi devono essere
  presenti nel campione da analizzare
• CARATTERISTICHE del batterio
• Il batterio, se si sceglie il metodo diretto,
  deve essere coltivabile (isolam) o in grande
  quantità (ELISA)
• VALORE DIAGNOSTICO DI UN EVENTUALE TITOLO
  ANTICORPALE
• Gli Ac devono, se presenti, voler dire qualcosa
• TIPO DI TEST
• Screening, test su caso sospetto e conferma?

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CAMPIONI CLINICI per la diagnosi diretta

• CAMPIONI MONOMICROBICI
• DAL SANGUE
• Plasma Frazione liquida del sangue non coagulato.
• importante lanticoagulante
• Siero Frazione liquida del sangue coagulato
• LIQUOR CEFALORACHIDIANO
• Usare tale e quale

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CAMPIONI CLINICI per la diagnosi diretta
CAMPIONI POLIMICROBICI di solito vanno
trattati TAMPONI immersi in liquido di trasporto
(PBS, 20 FCS o BSA, antibiotici,
antimicotici) URINA diluita 12 in
VIB Filtrata, centrif a 15000 Semina del
pellet FECI Diluite 15 o 10 in VIB. Centrif a
bassa velocità. Supernatante centrif a alta
velocità. Semina del pellet (cloroformio) BRONC
OLAVAGGI diluiti, rimosso muco. GARGARIZZATI
Tenute le cellule BIOPSIE omogenate in VIB,
centrif.
9
Diagnosi diretta

• Nella diagnosi diretta, la sierologia è deputata
  al
• riconoscimento del germe.
• Si acquistano già pronti anticorpi di origine
  animale, marcati diversamente a seconda del loro
  uso.
• Molto usati sono gli
• ANTICORPI MONOCLONALI.

10
L'agglutinazione permette di individuare anche
antigeni solubili multivalenti (antigeni
capsulari) avvalendosi di matrici inerti al
lattice ( di forma generalmente sferica)
coniugate con immunoglobuline specifiche note
sensibilizzate (le immunoglobuline sono legate
sulla superficie delle sfere) dirette contro un
certo antigene. L'agglutinazione si visualizza
con formazione di granuli sul fondo della
provetta o su particolari cartoncini a fondo
scuro. 
AGGLUTINAZIONE (metodo diretto)
  Una colonia del batterio in esame viene
stemperata in una goccia di antisiero o di
anticorpo monoclonale, specifico per il batterio
sospettato (Salmonella, Brucella) posta su
vetrino se l'anticorpo riconosce il
microrganismo reagisce con i corpi batterici,
causando, entro pochi minuti, la loro
agglutinazione visibile ad occhio nudo. Le
reazioni di agglutinazione su vetrino possono
essere rese più evidenti impiegando anticorpi
preventivamente coniugati con particelle di
lattice in tal modo l'agglutinazione può essere
osservata agevolmente a occhio nudo anche quando
gli anticorpi reagiscono con specifiche strutture
antigeniche poco rappresentate nel corpo
batterico. L'agglutinazione con anticorpi
coniugati a particelle di lattice viene impiegata
con successo per la diagnosi rapida di
Staphylococcus aureus, Streptococchi patogeni,
Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae,
Cryptococcus neoformans, Candida albicans.
11
REAZIONI ANTIGENE-ANTICORPO
12
ELISA (ENZYME LINKED IMMUNOASSORBENT ASSAY)
(metodo diretto)

• E una tecnica fra le più usate Semplice,
  sensibile, veloce (2 ore alla risposta),
  economica, reagenti stabili.
• Puo essere resa quantitativa con una curva di
  taratura.

Campione Es feci,urina etc
Perossidasi o Fosfatasi alcalina
Anticorpo marcato con enzima
microrganismo
Anticorpo che cattura
13
ELISA diretto per la ricerca di antigeni nei
campioni biologici
14
FASE 1 L anticorpo di cattura immobilizzato su
fase solida lega l antigene se questo è presente
nel campione
15
FASE 2 dopo lavaggio viene aggiunto il
secondo anticorpo che lega l antigene solo se
questo è stato precedentemente legato
16
FASE 3 dopo ulteriore lavaggio viene
aggiunto il substrato. Si sviluppa una reazione
colorimetrica solo in presenza dell enzima
perossidasi. Se il pozzetto si colora, la
reazione è positiva
FASE 4 Si blocca la reazione e si effettua la
lettura fotometrica
17
IMMUNOFLUORESCENZA (metodo diretto)

• E una delle tecniche più sensibili (fino a 1000
  molecole antigeniche se localizzate).
• Serve per rilevare antigeni (si adoperano
  anticorpi noti) anche a localizzazione
  intracellulare (Chlamidia, Rickettsiae).
• Permette di
• visualizzare la localizzazione di un antigene
  (citoplasmatica, di membrana, nucleare).
• determinare più antigeni o marcatori sulla stessa
  cellula, utilizzando fluorocromi diversi

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Immunofluorescenza diretta
19
Immunofluorescenza diretta
20
Immunofluorescenza diretta
21
Immunofluorescenza diretta
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Metodi indiretti

• Fissazione del complemento
• Agglutinazione
• Precipitazione
• ELISA
• Immunofluorescenza IFA
• Western blot

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SIERODIAGNOSI indiretta

• Per la ricerca delle IgG occorrono campioni
  appaiati
• A 7 gg dalla comparsa dei sintomi IN FASE ACUTA
• A 1-2 settimane dal primo IN CONVALESCENZA
• E considerato indicativo di infezione un
  titolo almeno 4 volte maggiore nel secondo
  campione
• Per la ricerca delle IgM basta un campione solo.
• Compaiono nei primi giorni
• Il picco è dopo 7-10 gg
• Scompaiono nei mesi successivi. SONO QUINDI
  INDICATORI DI INFEZIONE ACUTA
• Ricompaiono durante le infezioni ricorrenti e
  riacutizzazioni
• Determinate nel sangue cordale, indicano
  infezione neonatale

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SIERODIAGNOSI indiretta

• Gli anticorpi possono essere chiamati
  diversamente a seconda del saggio usato per
  determinarli e della loro funzione
• Agglutinanti o opsonizzanti (agglutinine e
  opsonine)
• Fissanti il complemento compaiono più lentamente
  e spariscono prima..
• I test disponibili danno come risultato il
  titolo
• delle Ig
  totali.
• Poco sensibili.
• Ig totali
• misurate con RIA o ELISA o IFA.
• I test possono determinare anche la classe IgM,
  IgG, IgA.
• Test di conferma Western blot o Immunoblot

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TEST DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO

• Originariamente messo a punto da Wassermann per
  la diagnosi di sifilide.
• Misura IgG e IgM (ossia gli anticorpi in grado di
  attivare o fissare il complemento C) nel siero

• Vantaggi stessi reagenti eccetto lantigene, per
  tutti i test
• Svantaggi componenti labili,
• stretto margine di condizioni ottimali

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TEST DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO
batterici
Sistema rivelatore un altro complesso antigene
anticorpo VISIBILE, cioè globuli rossi con
anticorpi anti-globulo rosso (si dicono
sensibilizzati)
27
TEST DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO
/-

Reazione di Wassermann Diagnosi sierologica della
sifilide utilizza sia lantigene lipoideo che
lantigene proteico
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AGGLUTINAZIONE e PRECIPITAZIONE (metodo indiretto)
Reazione antigene-anticorpo applicata a scopo
sierodiagnostico per individuare la presenza di
agglutinine (anticorpi agglutinanti) nel siero di
pazienti.
PRECIPITAZIONE (in cui si utilizzano antigeni
solubili non legati a cellule) AGGLUTINAZIONE (
in cui sono necessarie cellule nella loro
interezza per formare un reticolo dato
dall'unione dell'anticorpo a due cellule
contigue).   A differenza dell'agglutinazione,
la precipitazione è più rapida (15 min.) anche a
temperatura ambiente (20-25C) ma risente in
maggior misura del rapporto ottimale
antigene-anticorpo, inoltre non si manifesta
quando i sieri campione sono diluiti oltre 10-50
volte
29
AGGLUTINAZIONE (metodo indiretto)
LA SIEROAGGLUTINAZIONE DI WRIGHT E LA RICERCA DI
AGGLUTININE NEL SIERO DEL PAZIENTE NEI CONFRONTI
DI UNA SOSPENSIONE DI BRUCELLE IN FASE S. SI
PREPARANO DILUIZIONI SCALARI DEL SIERO (150 a
13200) E SI AGGIUNGE UNA OPPORTUNA QUANTITA DI
SOSPENSIONE ANTIGENE. LA LETTURA SI ESEGUE DOPO
48h A 37C INDICANDO IL TITOLO SIGNIFICATIVO
CIOE UN TITOLO SUPERIORE A QUELLO RISCONTRATO
NELLA POPOLAZIONE NORMALE (superiore a
1100) LA REAZIONE DI WIDAL E UTILIZZATA PER
EVIDENZIARE INFEZIONI SOSTENUTE DA SALMONELLA
TYPHI E SALMONELLA PARATYPHI. PREFERIBILMENTE
VIENE ESEGUITA UTILIZZANDO SOSPENSIONI SEPARATE
DI ANTIGENE O ED H PERCHE LA POSITIVITA VERSO
LUNO O LALTRO DEI DUE ANTIGENI HA UN
SIGNIFICATO CLINICO DIFFERENTE AGGLUTINAZIONE
FIOCCOSA PER LANTIGENE H AGGLUTINAZIONE
GRANULARE PER LANTIGENE O LA REAZIONE E
CONSIDERATA POSITIVA SE SUPERIORE AD 150
30
TPHA (reazione di emoagglutinazione indiretta)
Agglutinazione indiretta di emazie di pulcino con
anticorpi specifici contro le varianti patogene
di Treponema pallidum
31
TPHA
n cupule 1 2 3 4
Notation de l'importance de l' Hémagglutination          -    - 
32
n 1 2 3 4 5 6 7 8
tampon en  µl   25 25 25 25 25 25 25
sérum 1/20  en  µl 25 25
HS  en  µl 75 75 75 75 75 75 75 75
Dilution 1 / 80 1 / 160 1 / 320 1 / 640 1 / 1280 1 / 2560 1 / 5120 1 / 10240
Lecture - - -

Titolo risultante 1 a 1280, diluizione in cui è
ancora possibile verificare un agglutinazione
netta.
33
PRECIPITAZIONE (metodo indiretto)
La precipitazione avviene quando l'antigene in
soluzione acquosa, viene posto a contatto con
l'anticorpo (siero) in presenza di elettroliti
(soluzione fisiologica) ad una opportuna
temperatura e tempo di incubazione.
Il titolo precipitante di un siero è determinato
valutando la più piccola quantità di esso che sia
in grado di precipitare una quantità standard
fissa di antigene. Il grado di attività di un
siero è indicato dall'ultima diluizione che
consente di evidenziare la reazione.
34
ELISA (metodo indiretto)

• E una tecnica fra le più usate Semplice,
  sensibile, veloce (2 ore alla risposta),
  economica, reagenti stabili.
• Puo essere resa quantitativa con una curva di
  taratura.

• CATTURA DI ANTICORPO per diagnosi indiretta
• A, legato a supporto solido (fondo di piastra o
  biglia), è antigene virale
• B è un anticorpo specifico per A (per es nel
  siero di un paziente sieropositivo).

35
ELISA indiretto

• Un microrganismo, o antigeni di, è legato al
  supporto. Si ricerca nel siero lanticorpo.
• Nel passaggio successivo si usano Ig anti-Ig
  umane marcate con perossidasi.

Campione siero
Anticorpo marcato con enzima
Anticorpo
microrganismo
36
ELISA
37
Elisa indiretto
38
FASE 1 gli anticorpi specifici presenti nel
siero (Ac primario) si legano all antigene
immobilizzato su fase solida
39
FASE 2 dopo lavaggio viene aggiunto l Anticorpo
anti-immunoglobulina di specie marcato con
perossidasi(Ac secondario). Se sono presenti
anticorpi nel siero primario, si forma un
complesso antigene- Ac primario- Ac secondario
40
FASE 3 dopo ulteriore lavaggio viene aggiunto
il substrato. Si sviluppa una reazione
colorimetrica solo in presenza dell enzima
perossidasi. Se il pozzetto si colora, la
reazione è positiva
41
Immunofluorescenza indiretta
1)    microrganismo o antigene noto  2)  si
aggiunge il siero campione contenente eventuali
anticorpi diretti contro il microrganismo o
antigene noto  3)  si lava per allontanare
l'eccesso di anticorpo non legato al
batterio  4) si aggiunge un anticorpo marcato
diretto contro la regione costante della catena
pesante degli anticorpi eventualmente presenti
nel siero saggiato  5)  si lava per allontanare
l'eccesso di anticorpo marcato  6)  si osserva
con il microscopio a fluorescenza
   Il metodo indiretto consente di identificare
una grande varietà di antigeni utilizzando un sol
tipo di anticorpo rivelatore. Infatti
quest'ultimo essendo diretto contro la regione
costante della catena pesante delle
immunoglobuline può essere utilizzato
indifferentemente verso qualsiasi anticorpo
utilizzato per il riconoscimento dell'antigene.
42
WESTERN BLOT o IMMUNOBLOT
Test che misura la PRESENZA di anticorpi nel
siero. Non è quantitativo. E utilizzato solo
come test di conferma a causa del suo costo e/o
laboriosità. CONSENTE LA VISUALIZZAZIONE DEI
SINGOLI ANTIGENI CONTRO CUI E RIVOLTA LA
RISPOSTA ANTICORPALE
43
Western blotting

• Identifica gli antigeni verso cui reagisce un
  siero
• L identificazione avviene in base al peso
  molecolare della proteina
• E un test molto sensibile e specifico
• E un test costoso e poco pratico da applicare
  routinariamente

44
Principio del test

• L antigene (spesso una miscela di antigeni)
  viene sottoposto ad elettroforesi su gel di
  poliacrilammide
• Il gel viene fissato e le diverse frazioni
  vengono trasferite su matrice solida (membrana di
  nitrocellulosa)
• Su tale membrana vengono saggiati i sieri (1 per
  ogni striscia)
• Gli anticorpi specifici vengono visualizzati
  mediante anti-IgG di specie marcate e substrato
  colorimetrico

45
1 fase separazione elettroforetica
46
1 fase separazione elettroforetica
47
1 fase separazione elettroforetica
48
1 fase separazione elettroforetica
49
2 Fase trasferimento su membrana
50
3 fase preparazione delle strisce di
nitrocellulosa
51
3 Fase preparazione delle strisce di
nitrocellulosa
La membrana viene tagliata in strisce verticali
Ogni striscia contiene tutto il pool di proteine
separate mediante elettroforesi
52
4 Fase immunostaining
53
Interpretazione dei risultati
54
Identificazione dei microrganismi

• esame microscopico diretto del materiale in esame
• Caratteristiche morfologiche
• Colorazione di Gram
• Colorazione di Ziehl-Neelsen
• Caratteristiche colturali
• Caratteristiche biochimiche
• Tipizzazione fagica
• Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)
• Antibiogramma

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VALUTAZIONE IN VITRO DELLE RESISTENZE AGLI
ANTIBIOTICI
Il test di sensibilità agli antibiotici o agenti
antibatterici serve non solo per orientare la
terapia antibiotica , ma anche per monitorare
l'evoluzione della resistenza batterica e dare
quindi le basi del trattamento empirico delle
infezioni batteriche. La NCCLS  (National
Committee for Clinical Laboratory Standards)
detta le regole a livello internazionale su come
fare i test di sensibilità agli antibiotici
(antibiogramma), le classi di antibiotici da
testare ecc. In pratica questa analisi viene
standardizzata in funzione di fattori quali la
purezza del ceppo da testare, la densità
dell'inoculo, le condizioni di incubazione, il
metodo di lettura del risultato e soprattutto i
criteri biologici e clinici per l'interpretazione
del risultato.
56
L'importanza dell'antibiogramma   si basa sul
principio che la sensibilita' in vitro prefigura
l'efficacia in vivo della terapia antibiotica .
57
Concentrazione minima inibente (MIC)
Quello che andiamo a determinare oggettivamente
nel test di sensibilità agli antibiotici è la
cosidetta MIC o minima concentrazione inibente
(MCI o CIM ). La MIC è definita come la minima
concentrazione in un range di diluizione di
antibiotico che inibisce la crescita visibile
batterica. Purtroppo il clinico non sa
interpretare correttamente la MIC e chiede solo
se il ceppo è Sensibile o Resistente. Pertanto
molti test di laboratorio non misurano la famosa
MIC ma una stima della MIC semiquantitativa.
Questa stima meno accurata della MIC è data da 2
concentrazioni di antibiotico note come
breakpoints che determinano le 3 categorie piu'
conosciute dal clinico che sono S,I,R. La scelta
di queste 2 concentrazioni è data dal NCCLS che
usa criteri batteriologici, farmacocinetici e
clinici.
58
Concentrazione minima inibente (MIC)
Questi criteri vengono aggiornati di anno in
anno. La definizione di queste 3 categorie
secondo il NCCLS è la seguente Sensibile S la
categoria sensibile significa che l'infezione
causata dal   ceppo presuntivamente  responsabile
di quella infezione, isolato dal materiale
patologico e la cui importanza è valutata sia dal
microbiologo che dal clinico, puo' essere
trattata con quell'antibiotico al dosaggio usuale
raccomandato e che troviamo nei foglietti
illustrativi che accompagnano per legge il
farmaco.
59
Concentrazione minima inibente (MIC)
Intermedio I La categoria Intermedia significa
che la infezione causata dal   ceppo
presuntivamente  responsabile di quella
infezione, isolato dal materiale patologico e la
cui importanza è valutata sia dal microbiologo
che dal clinico,puo' essere trattata con
quell'antibiotico a un dosaggio leggermente piu'
alto di quello usuale. Resistente,R I ceppi
resistenti sono quelli non inibiti dalle
concentrazioni sistemiche dell'antibiotico ai
dosaggi normali e anche a quelli piu' alti.
60
I dati dell'antibiogramma dovrebbero essere
analizzati in termini di MIC, quindi di
differenze fra MIC e di livelli sierici
raggiungibili. Infatti 2 antibiotici di uguale
efficacia (cioè entrambi Sensibili) possono avere
MIC e livelli sierici diversi va scelto quello
con MIC piu' bassa ma anche con livelli sierici
migliori perchè cosi' è possibile somministrarlo
a dosaggi piu' bassi ossia meno frequentemente
migliorando la compliance del paziente, ma anche
il rapporto costo-effetto
61
Il Vitek è un apparecchio automatico per
l'identificazione e l'antibiogramma. Ha una
temperatura nell'incubatore delle cards di 35C
- 0.4 e non a 37C perchè solo a 35C si esprime
la meticillino resistenza. L'incubazione deve
essere prolungata per almeno 24 ore. Il
MicroScan della Dade Behring è un apparecchio per
l'identificazione e il test di sensibilità
approvato dalla NCCLS in quanto ne segue
strettamente le raccomandazioni. Il Vitek è stato
approvato dalla NCCLS solo per l'identificazione,
mentre è approvato per i test di sensibilità da
altri organismi internazionali.
62
(No Transcript)
63
(No Transcript)
64
Tecnica della diluizione
65
La tecnica della diluizione in brodo determina
accuratamente la MIC. Si parte da un inoculo
batterico di 100,000 organismi/ml in brodo
nutritivo che vengono posti in una serie di
provette o pozzetti che contengono diverse
concentrazioni di antibiotico. -Dopo incubazione
di 18-24 ore otteniamo dei risultati che devono
essere interpretati. - minima concentrazione
inibente  (MIC) è  3.1 ug/ml  - minima
concentrazione battericida (MBC) è 6.2 ug/ml
66
Ricordiamo che la MIC in quanto indica una
inibizione della crescita non indica che il
batterio a quella concentrazione venga ucciso
(sebbene in pratica una lunga inibizione della
crescita conduca alla eliminazione del batterio
attraverso le difese immunitarie nell'ospite
normale). - MBC è normalmente superiore alla
MIC. Dato che comporta la semina del brodo su
agar , il test ha delle limitazioni per il tempo
che si perde e i costi. E' richiesto per il
trattamento di affezioni molto difficili da
eradicare quali l'endocardite e l'osteomielite.
67
Tecnica della diffusione (Kirby-Bauer)

• I test di diffusione sono semplici ed economici.
  In questi test un inoculo standardizzato del
  microrganismo da saggiare viene seminato sulla
  superficie di una piastra di agar su cui
  successivamente si pongono dei dischetti di carta
  assorbente contenenti quantità standardizzate dei
  vari farmaci antimicrobici da saggiare.
• La zona di inibizione che si ottiene con il test
  di diffusione è correlata in maniera inversa alla
  MIC

68

• il metodo di Kirby Bauer o della diffusione dai
  dischetti , parte da una certa densità di inoculo
  che viene piastrato su agar Mueller-Hinton. La
  standardizzazione evita gli errori di
  inaccuratezza
• un inoculo ad alta densità di partenza
  corrisponde ad aloni di inibizione più piccoli e
  quindi a false resistenze. L'inoculo andrebbe
  sospeso in brodo Muller-Hinton a una densità di
  0,5 MC Farland.
• La piastra va prima posta a temperatura ambiente
  e dopo fatto lo spatolamento si lascia asciugare
  l'inoculo.
• I dischetti hanno un diametro standard di 6 mm.
  La distanza dal bordo della piastra deve essere
  di almeno 15 mm, mentre la distanza tra i
  dischetti deve essere di 20 mm.
• Si incuba a 35C. Le piastre vanno rovesciate a
  evitare la condensa.

69
Tecnica della diffusione (Kirby-Bauer)
70
(No Transcript)
71
L'E test o epsilon test dalla forma dell'alone di
inibizione, è un metodo quantitativo che
determina la MIC. Una striscia di plastica
impregnata da un gradiente calibrato di
antibiotico è posto su una piastra dove è stato
posto un inoculo standard del batterio isolato.
La MIC è facilmente letta lunga la striscia
laddove le colonie intersecano la striscia. In
questa immagine , le colonie attraversano la
striscia  a un valore di 0,94 µg/ml..
72

• Spesso si notano colonie isolate all'interno
  dell'alone di inibizione. Possono essere o
  mutanti resistenti o colonie estranee dovute a
  coltura mista.
• Una piastra incubata in CO2 fa diminuire
  l'attività dei macrolidi e degli aminoglicosidi,
  mentre fa aumentare l'attività dei beta lattamici
  e delle tetracicline.
• Gli aloni di inibizione correlano
  approssimativamente con le MIC. Diametri di
  inibizione superiore a un certo valore indicano
  sensibilità, diametri inferiori resistenza e fra
  questi due valori si definisce il ceppo a
  sensibilità intermedia.

73
Sia nel test di Kirby Bauer che nelle diluizioni
in brodo di apparecchi automatici   si usano 2
valori limite o di cut off detti break-points che
sono stabiliti dalla NCCLS. In genere si
saggiano centinaia di ceppi batterici e si
calcola la MIC 90 , cioè la MIC che inibisce la
crescita del 90 dei ceppi e questo valore è il
breakpoint 2. La MIC 60 stabilisce grosso modo
il break point piu' basso. Quando il ceppo è
inibito al BP piu' basso è Sensibile, se è
inibito solo al BP piu' alto è Intermedio, se è
inibito alle 2 concentrazioni è Resistente.
74
Anche il siero del paziente che sta assumendo
antibiotici può essere saggiato. Il sangue è
prelevato al picco dell'antibiotico utilizzato,
quindi il siero è diluito in brodo e testato
contro l'isolato microbico. Questo test è
raramente effettuato e solo per i casi di
endocardite , osteomielite o sepsi nel paziente
immunocompromesso. Il ceppo isolato viene
conservato e si cimenta con il siero diluito. Si
registrano le provette limpide che si seminano su
piastra. Si vede se cè stato killing o solo
inibizione