Pr

1
A
HIV-1
SU
TM
vpr
env
PR
RT
IN
tat
nef
pro-pol
R
U5
R
Psi
gag
vpu
vif
3 LTR
rev
MA
CA
NC
p6
5 LTR
SU
TM
HIV-2, SIVsm, SIVmac
vpx
vpr
env
PR
RT
IN
pro-pol
tat
nef
R
U5
R
Psi
gag
vif
rev
p6
3 LTR
MA
CA
NC
5 LTR
B
Bourgeonnement
Entrée
Assemblage
Récepteur cellulaire
ADN proviral
Traduction des ARNm
Transcription inverse
ARN viraux
Intégration
Noyau
Phases précoces de linfection
Phases tardives de linfection
Figure 1 Structure génétique (A) et cycle
réplicatif (B) des lentivirus. L'ARN génomique
des lentivirus de primates est encadré par les
LTR (long terminal repeat) et comprend les 3
gènes principaux gag, pro pol et env ainsi que
les gènes régulateurs tat et rev et accessoires
vif, vpr et nef. Certaines souches de lentivirus
comme HIV-2, SIVsm (sooty mangabey) ou SIVmac
(macaque) possèdent aussi le gène accessoire
vpx. Le cycle réplicatif lentiviral débute par
les phases précoces de l'infection
reconnaissance de la glycoprotéine d'enveloppe du
virus avec le récepteur cellulaire, entrée du
complexe nucléoprotéique dans le cytoplasme,
tanscription inverse, import nucléaire de l'ADN
proviral et intégration dans le génome
cellulaire, puis les phases tardives permettent
la transcription des ARN viraux et la traduction
des protéines virales, leur assemblage et la
formation de nouvelles particules virales
libérées hors de la cellule.
2
vpx vpr
vpr
vpx vpr
HIV-1 groupe M
HIV-1 groupe N
vpr
HIV-1 groupe O
vpx vpr
vpx vpr
vpr
Hu et al. 2003.
Figure 2 Arbre phylogénétique des lentivirus de
primates. (Hu et al 2003). Cet arbre a été
construit par la méthode du maximum de
vraisemblance à partir d'un fragment conservé du
gène pol. Les lentivirus de primates actuellement
connus sont divisés en 7 lignées (SIVsm/HIV-2,
SIVagm, SIVcpz/HIV-1, SIVmnd, SIVdrl et
SIVlhoest, le code de lettres minuscules
indiquant l'espèce hôte) dont 4 possèdent le gène
vpx (SIVsm/HIV-2, SIVrcm, SIVmnd et SIVdrl).
3
A
Macrophages
Cellules dendritiques
100
100
10
10
d'infection
1
1
0,1
0,1
1x
10x
1x
10x
B
Macrophages
Cellules dendritiques
100
100
10
10
d'infection
1
1
0,1
0,1
1x
10x
1x
10x
Figure 3 Vpx est nécessaire pour l'infection des
cellules dendritiques humaines par SIV. Des
cellules dendritiques (DCs) ou des macrophages
humains ont été transduits par des vecteurs
lentiviraux dérivés du SIV (A) ou du HIV-1 (B)
dépourvus de gènes accessoires ou possédant la
protéine accessoire Vpx du SIV (A) ou Vpr du
HIV-1 (B) avec deux quantités de vecteurs (1x ou
10x) normalisés par leur contenu protéique. Le
pourcentage de cellules transduites a été mesuré
3 jours plus tard par mesure de l'expression du
gène rapporteur gfp apporté par les vecteurs
viraux, par cytomérie de flux.
4
(No Transcript)
5
A
Virus original
env
pro-pol
gag
LTR 3'
LTR 5'
gène rapporteur
LTR 5'
LTR 3'
pro-pol
gag
Psi
VSV-G
pCMV
pCMV
eGFP
pCMV
Enveloppe
Vecteur auxiliaire
Vecteur
Lentivecteur
B
Lentivecteur
Plasmides
Transfection des 3 ADNs
Transduction
Expression du transgène
Gfp
Vecteur
Enveloppe
Cellule productrice du vecteur
Cellule cible
Vecteur auxiliaire
Figure 5 Principe des lentivecteurs. A La
séquence du génome viral est répartie sur 3
plamides différents l'un joue le rôle de génome
et comporte les séquences cis permettant sa
mobilisation, ainsi qu'une casette contenant un
gène rapporteur (ici l'eGFP enhanced Green
Fluorescent Protein) sous le contrôle du
promoteur CMV. Un deuxième plasmide contient un
gène d'enveloppe (ici la protéine G du VSV
permettant un large tropisme cellulaire). Enfin
un troisième plasmide code les gènes gag et
pro-pol des protéines de structure et des enzymes
virales respectivement. B La transfection de ces
3 plasmides dans une lignée cellulaire
productrice de vecteurs permet la formation de
particules contenant toutes les protéines virales
présentes chez le virus sauvage alors que le
génome encapsidé ne code que le gène rappoteur.
Les cellules cibles transduites par les vecteurs
produits expriment donc uniquement le gène
rapporteur.
6
Plasmides
génome
2. Purification des vecteurs produits sur double
coussin de sucrose
1. Transfection
3. Normalisation des vecteurs par titre infectieux
gag pol
Mesure de la GFP. Calcul du nombre de particules
infectieuses par ml de préparation.
enveloppe pantropique VSV-G
cellule 293T
cellule HeLaP4
4. Transduction des DCs à MOI 5
IL-4 GM-CSF
Mesure de la GFP
4 jours
Monocyte
DC
Figure 6 Représentation schématique des étapes
de la production des lentivecteurs et de la
transduction des DCs. Les plasmides sont
cotransfectés dans des cellules 293T. Deux jours
plus tard le surnageant des cellules est
centrifugé sur double coussin de sucrose afin de
purifier les lentivecteurs produits. Les
lentivecteurs sont ensuite titrés sur cellules
HeLaP4 puis normalisés par titre infectieux pour
transduire des DCs différenciées à partir de
monocytes du sang cultivés 4 jours en présence
d'IL4 et de GM-CSF à une MOI (multiplicity of
infection ou nombre de particules infectieuses
par cellule cible) déterminée.
7
Tableau 1 ADNs utilisés pour le clonage des
gènes vpx des souches SIVsmBPj, SIVsm660, SIVhu,
SIVrcm, HIV-2ROD et des gènes vpr des souches
SIVagm et HIV-1bcf. Une PCR a été réalisée avec
chaque couple d'amorce sur une matrice d'ADN
proviral plasmidique lorsqu'il était disponible
ou d'ADN obtenu après transcription inverse de
l'ARN viral. Les produits de PCR ont ensuite été
digérés par les couples d'enzymes correspondants
et introduits dans le plasmide pcDNA3
(Invitrogen). La séquence de chacun des gènes
amplifiés a été vérifiée.
8
(No Transcript)
9
(No Transcript)
10
(No Transcript)
11
(No Transcript)
12
B
A
Vpx SIVhu
Vpx SIVsm660
Vpx SIVsm PBj
Vpx HIV-2
Vpx SIVrcm
Vpx SIVmac
aucun Vpx
kDa
64,2
48,8
37,1
CA
25,9
19,4
14,8
Vpx
Vpx SIVhu
Vpx SIVsm660
Vpx SIVsm PBj
Vpx HIV-2
Vpx SIVmac
Vpx SIVrcm
aucun Vpx
C
D
Vpr SIVmac
aucun Vpr
Vpr SIVagm
kDa
37,1
CA
25,9
19,4
14,8
Vpr SIVmac
aucun Vpr
Vpx SIVmac
Vpr SIVagm
Figure 7 Restauration dela transduction des DCs
par un vecteur SIVmac en présence de Vpx ou Vpr
de différentes souches de lentivirus. Des DCs
humaines ont été transduites à une MOI de 5 par
des vecteurs SIVmac minimaux auquels ont été
apportés en trans l'un des Vpx (A) ou des Vpr (B)
des souches de lentivirus indiquées. Dans les
deux cas un contrôle a été réalisé avec un
vecteur SIVmac minimal. Le pourcentage de
restauration de la transduction des DCs est
indiqué pour chaque Vpx, par rapport à Vpx de
SIVmac servant de référence. B et D Analyse de
l'incorporation des Vpx (B) ou Vpr (D) dans les
particules virales SIVmac par empreinte western
réalisée sur des quantitées de lentivecteurs
normalisées par rest d'activité transcriptase
inverse exogène. Les anticoprs utilisés sont
dirigés contre la protéine p27 de la capside (CA)
du SIVmac, contre Vpx du HIV-2 (B) ou contre Vpr
du HIV-1 (D).
13
(No Transcript)
14
A
B
HIV-2 délété
HIV-2 sauvage
Vpx SIV mac
aucun Vpx
Vpx HIV-2
37,1
CA
25,9
19,4
14,8
Vpx
aucun Vpx
Vpx HIV-2
Vpx SIVmac
HIV-2 sauvage
HIV-2 délété
Figure 8 Défaut de transduction des DCs humaines
par un vecteur HIV-2 délété et restauration de la
transduction par l'apport de Vpx du SIVmac. Des
DCs humaines ont été transduites à des MOI de 5
ou 25 par un lentivecteur HIV-2 contenant tous
les gènes accessoires (A, HIV-2 sauvage), ou
possédant une délétion touchant vpx et vif (A,
HIV-2 délété, aucun Vpx), auquel ont été
apportées en trans les protéines Vpx du HIV-2 ou
du SIVmac. (B) Une empreinte western a été
réalisée sur des quantitées de lentivecteurs
normalisées par titre infectieux sur cellules
HeLaP4, avec un anticorps dirigé contre la
protéine p27 de la capside (CA) de SIV et un
anticorps dirigé contre Vpx du HIV-2.
15
A
B
HIV-1MVP
aucun Vpr
Vpr HIV-1 bcf
kDa
82,2
64,2
48,8
37,1
25,9
CA
19,4
HIV-1 8.91
14,8
Vpr HIV-1BCF
aucun Vpr
HIV-1MVP
Figure 9 Le vecteur HIV-1MVP peut trasduire les
DCs sans gène accessoire. A Des DCs humaines ont
été transduites à des MOI de 5 ou 25 par les
lentivecteurs minimaux HIV-1 8.91 ou HIV-1MVP
auquel a pu être apporté en trans la protéine Vpr
du HIV-1BCF, appartenant comme HIV-1MVP au groupe
O du HIV-1. B Une empreinte western a été
réalisée sur des quantitées de lentivecteurs
normalisées par titre infectieux sur cellules
HeLaP4, avec un anticorps dirigé contre la
protéine p27 de la capside (CA) de SIV et un
anticorps dirigé contre Vpr du HIV-1.
16
(No Transcript)
17
(No Transcript)
18
(No Transcript)
19
(No Transcript)
20
(No Transcript)
21
(No Transcript)
22
(No Transcript)