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Detec o de ANA por imunofluoresc ncia – PowerPoint PPT presentation

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Title: Detec


1
Detecção de ANA por imunofluorescência
2
Doenças Autoimunes
  • Ehrlich horror autotoxicus
  • Owens (1945) Apesar da partilha sanguinea os
    gémeos bi-vitelinos não se rejeitam tolerância
    imunológica ao gémeo
  • Billingham (1953)
  • transplantes em ratinhos adultos de estirpes
    diferentes são rejeitados
  • transplantes em ratinhos neonatais de estirpes
    diferentes são aceites mesmo depois de atingirem
    a vida adulta
  • Burnet (1956) Teoria da selecção clonal ou dos
    clones proibidos

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Mecanismos de tolerância Imunológica
  • Eliminação clonal
  • Anergia Clonal
  • Supressão da resposta imunitária (células T
    supressoras)
  • Falha na apresentação antigénica
  • Baixa expressão de HLA-II
  • Tecidos imunológicamente privilegiados
  • SNC (barreira hemato-encefálica)
  • Testiculo (baixa temperatura)
  • câmara anterior do olho (elevada TGFb)
  • Rede idiotipo-antiidiotipo

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Mecanismos de Indução de auto-imunidade (I)
  • Falha de eliminação clonal
  • Linfócitos B1(CD5)
  • Alterações na apresentação antigénica
  • Modificações dos autoantigénios
  • Mimetismo molecular
  • Expressão ectópica de HLA-II
  • Rotura de anergia clonal
  • IL-2
  • Expressão defeituosa de faz
  • Activação policlonal
  • LPS
  • Superantigénios
  • Rotura de anergia clonal
  • Falha da regulação da resposta imunológica
  • Falha das células supressoras mantém uma resposta
    em actividade
  • Regulação antiidiotipica
  • reacção cruzada com anticorpo anti bacteriano
  • Anticorpos mimetizando ligandos celulares,
    induzem respostas via receptores celulares
  • Equilibrio Th1/Th2
  • Regulação neuro-hormonal da resposta imunológica

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Patologias autoimunes sistémicas e de órgão
  • LES
  • Lúpus discóide
  • Esclerodermia
  • Citopenias autoimunes
  • Síndrome de Goodpasture
  • Cirrose Biliar Primária
  • Hepatite crónica activa
  • Síndrome Guillain-Barré
  • Uveite
  • Fibrose Pulmonar Idiopát.
  • Artrite reumatóide
  • Artrite reumatóide juvenil
  • Sindrome de Sjögren
  • DMID (Diabetes )
  • Psoriase
  • Doença de Graves
  • Doença de Hashimoto
  • Esclerose Múltipla
  • Colite ulcerosa
  • Doença de Chron
  • Miastenia Gravis

6
Rheumatoid Arthritis
  • An autoimmune disorder affecting connective
    tissue.
  • 3 million afflicted in US
  • Afflicts women during menopause
  • 48-52 years of age
  • shorten life expectancy by 3-7 years
  • Afflicts men women after 65 years of age
  • shorten life expectancy by 7-10 years for men.
  • Etiology
  • Combination of factors including a genetic
    predisposition and triggered by unknown
    infectious agent (possibly EBV).

7
Clinical Manifestations
  • Joint problems over time
  • Occur symmetrically
  • Alteration in the wrist
  • Ulnar drift
  • Boutonniere deformity
  • Swan-neck deformity
  • Rheumatoid nodules

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EXAMPLE OF ARTHRITIS OF THE LEFT KNEE
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Systemic Lupus Erythmatosus
  • Chronic, inflammatory, autoimmune disorder
  • 2 types discoid and systemic
  • Etiology - unclear
  • May be several risk factors - infection, exposure
    to UVB, environmental irritants

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Systemic Lupus Erythmatosus
  • Pathophysiology
  • Produce autoantibodies due to defect in
    T-suppressor cells NK cells are also suppressed
  • Autoantibodies - antinuclear antibodies (ANA)
  • when cell dies, nuclei bind with ANA, forms
    immune complex that stimulates inflammatory
    response
  • Immune complex also stimulates activation of
    complement

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Discoid Lupus
12
Lupus
13
(No Transcript)
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Malar Rash (Butterfly Rash)
Discoid Lesions a thick, disk-like rash that
scars, usually on sun-exposed areas
Arthritis inflammation of peripheral joints with
tenderness, swelling or effusion with skin changes
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Pericarditis
Oral Ulcers
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Diagnóstico de D. Autoimune (I)
  • Provas directas
  • Reprodução num recipiente normal por
    transferência de anticorpos
  • Não aplicável ao Homem
  • Provas indirectas
  • Reprodução em animais
  • por imunização com auto-antigénios
  • Requer conhecimento do auto-antigénio
  • Requer a administração de potentes adjuvantes
  • Por transferência de Linfócitos para ratinhos
    SCID
  • Identificação de auto-anticorpos ou células T
    auto-reactivas nos órgãos alvo

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Diagnóstico de D. Autoimune (II)
  • Provas circunstanciais
  • Associação com outras doenças auto-imunes
  • Infiltração linfocitica nos órgãos afectados
  • Associação com determinados haplotipos HLA
  • Detecção sérica de autoanticorpos
  • Resposta favorável a imuno-supressores

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(No Transcript)
19
Suggested Clinical and Laboratory Criteria
For The Diagnosis of Antiphospholipid
Syndrome
20
How is Lupus diagnosed?
  • When a doctor thinks a patient may have Lupus, an
    ANA blood test is ordered.
  • Other tests such as an anti-dsDNA, anti-Sm,
    anti-Ro/SS-A, and anti-RNP also may be ordered to
    determine if a patient has Lupus.
  • Complement tests are performed to measure the
    amount of complement proteins circulating in the
    blood.

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Diagnostic Studies
  • ANAs are the best screening test
  • Antibodies to double-stranded DNA (dsDNA) and to
    Sm are relatively specific for SLE
  • Determining the complete autoantibody profile of
    each patient helps predict clinical subsets. High
    serum levels of ANAs and anti-dsDNA and low
    levels of complement usually reflect disease
    activity, especially in patients with nephritis

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Algorithm for the diagnosis of SLE. ANA,
antinuclear antibody ACR, American College of
Rheumatology CTD, connective tissue disease
WBC, white blood cell count RBC, red blood cell
count, , recommended in initial evaluation.
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Diagnóstico de D. Autoimune (II)
  • Provas circunstanciais
  • Associação com outras doenças auto-imunes
  • Infiltração linfocitica nos órgãos afectados
  • Associação com determinados haplotipos HLA
  • Detecção sérica de autoanticorpos
  • Resposta favorável a imuno-supressores

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Doenças associadas a ANA
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Auto-antigénios detectáveis com as células Hep-2
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Protocolo para detecção de ANA com células Hep-2
(II)
  • Soro colhido fresco ou a 4ºC (1-2 semanas) ou a
    20ºC (periodos longos)
  • Evitar ciclos congelar/descongelar
  • Congelação pode concentrar o soro (liofilização)
  • Testar diluições seriadas do soro em PBS (140,
    180, 1160,...) (semi-quantificação do título,
    melhores padrões, evitar falsos positivos )

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Protocolo para detecção de ANA com células Hep-2
(II)
  • Láminas com as células Hep-2 em monocamada
    (vários poços/lâmina). Deixar as lâminas chegar a
    RT antes de abrir o pacote selado.
  • Adicionar o soro diluído a testar, e incubar 30
    min em incubadora húmida a RT
  • Lavar com PBS
  • Adicionar o secundário (cabra, ovelha ou coelho)
    marcado com FITC, e incubar como acima
  • Universal (anti IgH de IgG,IgM,IgA não
    purificado)
  • Anti-IgG (as mais importantes p/ diagnóstico)
  • Anti-IgM (SLE pediátrico)
  • Lavar com PBS
  • Contrastar com 1 a 2 gotas de Azul de Evans a 1
    por 100 mL PBS
  • Lavar com PBS
  • Montar em glicerol

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Padrões Hep-2 (I)
29
Padrões Hep-2 (II)
30
Padrões Hep-2
31
Padrões gerais ANA (Nucleares)
32
Tipos de padrões Hep-2
33
Resolução de Problemas
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