M

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• MÉTODOS LABORATORIAIS UTILIZANDO ANTICORPOS

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1- INTRODUÇÃO

• POR QUE UTILIZAR ANTICORPOS?
• QUAIS AS CARACTERÍSTICAS BÁSICAS E FUNDAMENTOS
  DOS ENSAIOS QUE UTILIZAM ANTICORPOS?

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1- INTRODUÇÃO

• 1.1- Principais características das Respostas
  Imunes Adquiridas
• Especificidade
• Diversidade
• Memória
• Especialização
• Autolimitação
• Não reatividade ao próprio

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1- INTRODUÇÃO

• 1.1- Principais características das Respostas
  Imunes Adquiridas
• Especificidade conferida por duas moléculas
  principais
• - TCR presente na membrana de linfócitos
• - Anticorpos produzidos por linfócitos B,
  presentes na membrana de linfócitos B e na forma
  secretada, solubilizados em diversos fluidos
  corporais.

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1- INTRODUÇÃO

• 1.2- Principais isotipos de anticorpos
• IgM
• IgG
• IgA
• IgE
• IgD

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1- INTRODUÇÃO

• 1.2- Principais isotipos de anticorpos
• IgM
• IgG encontrado em maior concentração no soro,
  de obtenção mais fácil, sofre maturação de
  afinidade
• IgA
• IgE
• IgD

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1- INTRODUÇÃO

• 1.3- Principais características dos Ensaios que
  utilizam Anticorpos
• -Especificidade Característica que indica que o
  teste em questão identificará somente o antígeno
  ou o anticorpo desejado.
• Quanto MAIOR a especificidade, MENOR a ocorrência
  de resultados falsos-positivos, MENOR a
  ocorrência de reações cruzadas.
• Dependente do tipo de anticorpo e antígeno
  empregado no teste, e do sistema de detecção da
  interação Ag-Ac.

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1- INTRODUÇÃO

• 1.3- Principais características dos Ensaios que
  utilizam Anticorpos
• -Sensibilidade Característica inerente ao método
  estreitamente relacionada com a quantidade mínima
  de antígeno ou anticorpo que poderá ser detectada
• Estreitamente ligada ao sistema de amplificação e
  detecção da interação Ag-Ac.
• Métodos enzimáticos, radioativos, fluorescentes,
  quimioluminescentes.

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1- INTRODUÇÃO

• 1.4- Fatores a serem analisados na escolha do
  método
• Sensibilidade
• Especificidade (confiabilidade de resultados)
• Custo
• Disponibilidade de material
• Segurança
• Aplicabilidade à amostra disponível, Ag/Ac a ser
  detectado e espécie animal a ser analisada
• Tempo de realização do método.

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1- INTRODUÇÃO

• 1.5 Aplicações dos métodos
• - Identificação e/ou quantificação de moléculas
  específicas em fluidos biológicos
• Purificação de proteínas
• Diagnóstico de doenças auto-imunes, infecciosas e
  hipersensibilidades
• Identificação de genes e seus produtos
• Localização de moléculas específicas em células e
  tecidos.

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

• HISTÓRICO
• CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS PRINCIPAIS MÉTODOS
  LABORATORIAIS QUE EMPREGAM ANTICORPOS
• VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS
• de

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

• 2.5- ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
  Técnica que utiliza Ag/Ac imobilizado em placa de
  polímero de carbono, e anticorpo conjugado a uma
  enzima, a qual, após agir sobre seu substrato em
  presença de substância cromógena, amplificará a
  detecção da interação Ag/Ac através da formação
  de cor
• Variações da Técnica ELISA Quimioluminescente,
  ELISA Fluorescente, ELISA Radioativo

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

• 2.5.1- ELISA Indireto

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ELISA INDIRETA
Anticorpo conjugado
IgM a ser detectada
Antígeno purificado
IgM inespecífica
TMB
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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

• 2.5.2- Quantificação de Ag/Ac em ELISA

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

• 2.5- ELISA
• Vantagens Método altamente sensível e
  específico, com alto grau de confiabilidade como
  ensaio quantitativo, custo baixo a médio.
• Desvantagens Devido a alta sensibilidade,
  pequenas variações de pipetagem e tempo de
  incubação podem ocasionar resultados alterados
  em extratos de antígenos, não se pode precisar a
  qual antígeno houve a resposta ELISA de
  competição muito susceptível a erros de
  manipulação.

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

• 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica
  Utilizados para detecção e localização de
  antígenos em células e tecidos e para detecção de
  anticorpos específicos em fluidos biológicos.
• Métodos de alta especificidade e alta
  especificidade
• Utilização de anticorpos conjugados com
  substâncias fluorescentes (FITC, FAC) na IFA, e
  de anticorpos conjugados com enzimas
  (Imunohistoquímica).

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

• 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

• 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica
• Vantagens Alta especificidade e sensibilidade
  possibilidade de detecção de proteínas
  intracelulares e de sua localização, bem como do
  tráfico intracelular.
• - Desvantagens variação individual na leitura
  de resultados de IFA alto custo de microscópio
  de fluorescência técnicas especiais de fixação e
  inclusão de tecidos para Imunohistoquímica nem
  sempre disponíveis.

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

• 2.7- Western-Blot Associação de técnica de
  Eletroforese em Gel de SDS-PAGE com técnicas
  imunológicas
• Permite a identificação do reconhecimento de
  antígenos com peso molecular definido
• Identificação de anticorpos que reconhecem
  determinado antígeno em solução contendo diversos
  antígenos
• Permite a realização de cinética de expressão de
  proteínas celulares.

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

• 2.7- Western-Blot

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

• 2.7- Western-Blot

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

• 2.7- Western-Blot
• Vantagens alta sensibilidade e especificidade
  reconhecimento de antígenos individuais em um
  extrato realização de perfil de reconhecimento
  de antígenos e determinação de proteínas
  imunodominantes
• Desvantagens Custo médio a alto procedimento
  longo e propenso a erros em diversos pontos
  dependendo do sistema de revelação, pode-se ter
  problemas de segurança.

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3- BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA

• Imunologia Celular e Molecular. Abbul K. Abbas
  Andrew H. Lichtman. Quinta Edição, Elsevier
  Editora
• Imunologia Médica. Abba I. Terr, Daniel P.
  Sittes Tristam. Décima Edição. Guanabara Koogan
  Editora.
• Imunologia Veterinária. Ian R. Tizard. Quinta
  Edição. Roca Editora.
• Imunologia. David Male, Ivan Roitt Jonathan
  Brostoff. Sexta Edição. Manole Editora.
• Imunobiologia O Sistema Imune na Saúde e na
  Doença. Charles Janeway, Paul Travers Mark
  Walport J. Donald Capra. Quinta Edição. Artmed
  Editora.
• Immunodiagnostics, A Practical Approach. Ray
  Edwards. Oxford University Press.
• Antibodies, A Laboratory Manual. Ed Harlow
  David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory Press.