D

1
Détection des Anticorps Anti-ADNnatif pour le
Diagnostic du Lupus Erythémateux Systémique

• Étude Comparative de 7 Trousses de Dosage
  Immuno-enzymatique et d'un Test de Farr.

2
Historique et épidémiologie de la maladie lupique

• Lupus signifie  loup  en latin ? formes
  cutanées

• Prévalence de 15 à 200 pour 100 000 habitants
• Fréquence plus élevée chez les sujets non
  caucasiens
• Prédominance féminine
• 8 à 9 femmes pour un homme
• Pic de fréquence entre 20 et 30 ans
• Étiologies facteurs génétiques, endocriniens,
  immunitaires environnementaux

Éruption en ailes de papillon (Hebra 1845)
Mais présence aussi de complications viscérales
3
Diagnostic clinique de la maladie lupique

• Définition de Dubois  Syndrome clinique
• de cause inconnue,
• avec atteinte systémique
• touchant un ou plusieurs appareils

• évoluant par poussées,
• entrecoupé de rémissions multiples .

• Critères de gravité de la maladie atteinte
  rénale, cardiaque, neurologique, hématologique
  (AHAI, purpura thrombopénique)

4
Diagnostic biologique de la maladie lupique

• Grande diversité dauto-Ac
• - Ac antinucléaires
• les plus spécifiques
• - anti-ADNnatif (40 à 90)
• - anti-Sm (5 à 30)
• - anti-PCNA (3 à 5),
• - Ac anti-phospholipides
• (20 à 40 des lupus),
• - Ac anti-cellules sanguines
• - Facteur rhumatoïde (30)

• Anomalies biologiques diverses
• 1) Signes hématologiques
• anémie, leucopénie, thrombopénie
• 2) Signes inflammatoires
• - Hyper?globulinémie polyclonale
• - Dissociation VS, CRP
• 3) Cryoglobulinémie (III)
• 4) Activation du complément
• CH50, C3, C4 (C1q).

5
Critères de classification de lACR

• 1 Éruption malaire en ailes de papillon
• 2 Lupus discoïde
• 3 Photosensibilité
• 4 Ulcérations buccales et nasopharyngées
• 5 Polyarthrite non érosive
• 6 Pleurésie ou péricardite
• 7 Atteinte rénale protéinurie ?0.5 g/24 h,
  cylindres urinaires
• 8 Atteinte neurologique convulsions, psychose
  (sans médicaments inducteurs)

9 Atteinte hématologique Anémie hémolytique
avec hyper-réticulocytose ou leucopénie ? 4
000/mm3 constatée au moins à 2 reprises ou
lymphopénie ? 1 500/mm3 constatée au moins à 2
reprises ou thrombopénie ? 100 000/mm3 en
l'absence de cause médicamenteuse 10 Désordre
immunologique anticorps anti-ADN natif,
anticorps anti-Sm, anticorps anti-phospholipides
(soit anti-cardiolipine de type IgG ou IgM à taux
élevés, ou anticoagulant circulant lupique, ou
sérologie syphilitique dissociée) 11 Présence
d'un titre anormal d'anticorps anti-nucléaires.
6
Les Anticorps anti-ADN natif

• Ac anti-ADN natif Anticorps anti-nucléaires
  dirigés contre lADN du nucléosome. Il existe 3
  types dAc anti-ADN
• - Ac anti-ADN natif dirigés contre lADNdb seul
  ou lADNdb et lADNsb
• - Ac anti-ADN dénaturé dirigés uniquement
  contre lADNsb.

Discordances Pas de règle 100 établie!!
7
Les méthodes de détection des Ac anti-ADN natif

• Recherche des anticorps anti-nucléaires par
  Immunofluorescence indirecte sur cellules HEp-2.

• Confirmation de la spécificité  anti-ADNn  et
  dosage par
• 3 méthodes distinctes
• Test de Farr
• Immunofluorescence sur Crithidia luciliae
• Technique ELISA

8
Les méthodes de détection des Ac anti-ADN natif
9
Objectifs de ce travail

• Enquête rétrospective
• Évaluation des performances de 7 coffrets de
  dosage immuno-
• enzymatique des Ac anti-ADN natif par rapport au
  test de Farr
• utilisé en routine dans le laboratoire
  dImmunologie du CHRU
• de Lille.

10
Sérums et patients

• Critères biologiques de sélection des 80 sérums
• 76 sérums avec un titre en anticorps
  anti-nucléaires ?1/320e en IFI
• 43 sérums Farr
• 33 sérums Farr
• 4 sérums avec taux dalpha foeto-protéine (AFP)
  ?4000?g/L (seuil à 10?g/L)

• Répartition clinique
• 70 pathologies auto-immunes
• 53 lupiques
• 17 non lupiques autres maladies
• auto-immunes (SAPL, GS, myasthénie)
• 10 autres pathologies (Raynaud, pneumopathie,
  hépatopathie)

N44 Sex ratio(F/H)93 Age15-78 ans (moyenne
42ans) Sévérité Forme bénigne 18 (8/44)
Forme modérée 48 (21/44) Forme grave 34
(15/44) Traitement 43/44 (97) Association à
dautres MAI 45.5 (20/44)
11
Matériel et méthodes

• Les 7 coffrets ELISA
• - Test 1 société Bio Advance,
• - Test 2 société Sanofi Pasteur Diagnostics
  (Biorad),
• - Test 3 et 4 société BMD,
• - Test 5 société The binding site,
• - Test 6 société Menarini Diagnostics,
• - Test 7 société Pharmacia Upjohn.
• Test de Farr Société
• Ortho Clinical Diagnostic

• Méthodologie identique
• 1) Incubation des sérums dans les puits coatés
  dADNbicaténaire,
• 2) Lavage,
• 3) Incubation en présence du conjugué,
• 4) Lavage,
• 5) Incubation en présence du substrat,
• 6) Révélation (lecture de DO).
• Mais différences entre les trousses
• - Nature de lantigène, de lanticorps
• - Autres temps dincubation, dilution
• des sérums, nombre de calibrants,
• DO de référence et la valeur seuil
• Calcul dun seuil arbitraire

12
Dosages des Ac anti-ADN natifs obtenus par le
test de Farr et différents coffrets ELISA chez
les patients lupiques
220
110
100
90
80
70
UI/mL
60
50
40
30
20
Seuil arbitraire
10
0
Farr
Sanofi
BMD a
BMD b
Menarini
Pharmacia
BioAdvance
The Binding site
13
Dosage des Ac anti-ADN natifs obtenus par le test
de Farr et différents coffrets ELISA chez les
patients non-lupiques
220
110
100
90
80
UI/mL
70
60
50
40
30
20
Seuil arbitraire
10
0
Farr
Sanofi
BMD a
BMD b
Pharmacia
Menarini
BioAdvance
The Binding site
14
Indices informationnels

• Performances du test de Farr Sensibilité71
  
• Spécificité78
• Ac de haute affinité Maladie lupique évolutive
• 89 des lupus avec Farr positif formes modérées
  ou graves
• Corrélation Titres/ Clinique seulement entre
  formes bénignes et graves
• Discordances clinico-biologiques
• - 28 lupus avec Farr négatif
• -supérieur à la littérature (8 à 22)
• -rarement formes bénignes
• -découverte récente
• -souvent atteinte articulaire
• -lupus traité
• - 18 non-lupiques avec Farr positif
• -SAPL le plus souvent

Contre performance?
Phase pré-sérologique?
Lupus éteints ou stabilisé sous traitement?
Phase pré-clinique de lupus biologique?
15
Indices informationnels
16
Comparaison Méthodes ELISA / Test de Farr

• Concordance des résultats MODESTE
• - Dans la population lupique de 43 à 73,
• - Dans la population non lupique de 34 à
  82,
• - Meilleure concordance globale avec les tests
  2 (68) et 7 (67).
• Corrélation des titres dAc anti-ADNn dans la
  population lupique ACCEPTABLE
• - Coefficient de corrélation de 0.24 à 0.67,
• - Meilleure avec les tests 2 et 6,
• - Meilleure pour les titres élevés en Ac
  anti-ADN natif.

17
Comparaison des méthodes ELISA

• Grande hétérogénéité des résultats obtenus
• Variation des sensibilités de 15 à 100
• Variation des spécificités de 15 à 94
• Concordance des résultats MAUVAISE
• - Dans la population lupique seulement pour 6
  sérums (11)
• Meilleure avec les 4 coffrets les plus sensibles
  82

18
Comparaison des méthodes ELISA

• Manque de standardisation global entre les 7
  coffrets même si étalonnés par rapport au même
  standard international W0 80
• Diagnostic biologique incohérent entre la
  majorité des trousses
• Suivi évolutif des patients lupiques non adapté
  par méthode ELISA

• Origines des discordances
• Facteurs extérieurs?
• Défaut intrinsèque?
• - Phase solidemanque de spécificité,
• - Imperfections des microplaques,
• - Ac anti-plastique.
• Différences entre les trousses?
• - Nombre détalons pour la calibration,
• - Nature du réactif conjugué (antiglobuline),
• - Origine de lAg.

19
Interférences

• Ac anti-Histones/ Ac anti-ADN dénaturé
• Résultats faux positifs avec 6 coffrets
• (Farr négatif et patients non lupiques).
• AFP
• Interférences avec 4 coffrets (tests 3, 4, 5 et
  7)
• Ac anti-phospholipides
• Résultats positifs avec 5 coffrets (sauf tests 5
  et 6 )
• Phase solide favorise les réactions croisées
  entre Ac anti-phospholipides et ADN,
• Or test de Farr positif pour 4 de ces sérums
  présence probable dAc anti-ADNn
  Phase pré-clinique de lupus?
• Facteur rhumatoïde et cryoglobuline
• Non représentatif dans notre enquête.

20
Intérêt dune démarche biologique hiérarchisée

• Recherche danticorps anti-nucléaires par IFI
  Présents dans 99 à 100 des lupus
• mais non spécifiques de la maladie
• (connectivites, affections inflammatoires,
  sujet âgé)

Test de 1ère intention
Aspect homogène en IFI avec titre?1/320e
Recherche dAc anti-ADNn
Détection par
-

Méthodes ELISA
IF-CL
Adapter selon dialogue clinico-biologique
Confirmation par test de Farr

• Suivi évolutif Test de Farr détecte une
  augmentation des Ac anti-ADNn
• dans 85 des cas de rechutes contre 75 pour
  ELISA et 63 pour lIF-CL
• Associer dautres paramètres biologiques
  CH50 et fractions

21
Conclusion

• Aucun coffret commercial ELISA natteint les
  performances du test de Farr car
• - Problèmes techniques
• - Encore trop de discordances et
  d'interférences
• - Absence de corrélation entre titre et
  sévérité clinique
• Choisir un coffret fiable
• Confirmation par test plus spécifique
• Importance du dialogue clinico-biologique