DESCOBRINDO GENES DE DOEN

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DESCOBRINDO GENES DE DOENÇAS HEREDITÁRIAS
Fabrício Pereira Francine Ribeiro Helene de Abreu
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ERROS INATOS DO METABOLISMO

• Fibrose Cística
• Deficiência de Glutationa sintetase
• Alcaptonúria

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Fibrose Cística
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Fibrose Cística

• Doença genética autossômica recessiva
• Crônica
• Resulta em alterações nas secreções causando um
  distúrbio funcional das glândulas exócrinas
  acometendo principalmente os pulmões, pâncreas,
  intestinos, fígado, glândulas sudoríparas e
  sistema reprodutor
• Mais comum em caucasianos
• Acomete células de vários órgãos.
• O gene foi mapeado em 1989.

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Genética

• O gene da FC localiza-se no braço longo do
  cromossomo 7, no lócus q31, formado por 250Kb de
  DNA, com 27 éxons e codifica um RNAm de 6,5Kb.
• Esse gene codifica para uma proteína chamada de
  reguladora da condutância transmembrana para
  fibrose cística (CFRT)
• A CFTR é também chamada de canal de cloro e é
  essencial para o transporte de íons pela membrana
  celular, estando envolvida na regulação do fluxo
  de cloro, sódio e água.

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Genética

• Podem ocorrer mais de mil mutações nesse gene
• A mais conhecida é a deleção de três pares bases
  nitrogenadas no éxon 10 do gene CFTR, acarreta
  perda do aminoácido fenilalanina na posição 508
  da molécula da proteína CFTR.
• Conhecida como mutação ?F508.

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• Os tipos de mutações podem ser agrupados em 6 clas
  ses 
• 1-CFTR não é produzida 
• 2-defeitos no processamento 
• 3-regulação defeituosa 
• 4-condutância defeituosa 
• 5-produção parcialmente defeituosa 
•  6-regulação defeituosa de outros canais
• Classe 1-3 de mutações são mais comuns 

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Fisiopatologia

• As mutações no gene da fibrose cística, provocam
  redução na excreção do cloro.
• Com o aumento da eletronegatividade intracelular,
  há maior fluxo de sódio para preservar o
  equilíbrio eletroquímico e secundariamente de
  água para a célula, por ação osmótica.

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Manifestações clínicas

• Extremamente variadas
• Forma clássica
• Tosse crônica
• Diarréia crônica
• Desnutrição
• Suor salgado

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Diagnóstico

• O exame padrão é o teste do suor com dosagem de
  sódio e cloro.
• Diagnóstico Molecular- Baseia na análise das
  mutações, cuja maioria é particular em populações
  específicas ou grupos étnicos

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Terapia Gênica

• Introdução de cópias simples do cDNA normal
  correspondente à sequência codificadora do gene
  FC em células portadoras do defeito FC
• Restaurando sua função normal de condutância do
  Cloro.
• O gene pode ser liberado para um número
  suficiente de células in vivo e a função normal
  da proteína será restabelecida, podendo-se
  prevenir as manifestações da doença ou
  amenizá-las.

Cópias de cDNA
Célula portadora de defeito
função normal da proteína
vetores
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Terapia Gênica

• Muito indicada, mas ainda sob pesquisa
• Vetores virais e não virais estão sendo
  estudados
• Ainda não se chegou a um sistema de vetor ideal.

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Métodos para detectar mutações

• Muitas técnicas estão disponíveis para
  identificar na sequência do gene da CFTR.
• As metodologias podem ser
• genotipagem- técnicas que detectam variantes
  alélicas conhecidas
• triagem- técnicas que procuram por qualquer
  alteração em determinada região.

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• As técnicas de genotipagem para análise do gene
  CFTR são
• análise de polimorfismo de comprimentos de
  fragmentos de restrição (RFLP),
• ensaio qualitativo de PCR em tempo real, entre
  outras.

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• Entre o método de triagem pode ser destacado
• análise de dissociação em alta resolução (HRM)
• O sequenciamento pode ser usado para confirmar o
  método de triagem ou ser usado diretamente para
  identificar as mutações.

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HRM Análise de dissociação em alta resolução

• Fluoróforo se intercala no DNA de dupla fita é
  adicionado na PCR antes da amplificação.
• Gera uma curva onde a fluorescência é coletada e
  decresce conforme a desnaturação.

• A identificação da alteração é através da
  distorção que ocorre na curva quando comparadas
  com amostras de controle.
• A amostra que apresenta distorção deve ser
  sequenciada para identificar a mutação

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HRM

• Não precisa de processamento entre a amplificação
  de PCR
• Análise do produto apresentam vantagens para o
  diagnóstico molecular
• risco de contaminações e tempo.

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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Deficiência da glutationa sintetase
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Glutationa
Proteção das células contra danos oxidativos.
Manutenção de grupos sulfidrilas de proteínas no
estado reduzido
envolvimento no transporte de aminoácidos
Co-fator para um número de enzimas
Participação na desintoxicação de compostos
estrangeiros
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(No Transcript)
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• Estudos genéticos revelaram que as mutações no
  gene GS humanos que levam à deficiência de SG e
  sugerem a perda completa da função é
  provavelmente letal ( Shi et al 1996., Dahl et
  al 1997., )
• A frequência é baixissima sendo registrados
  aproximadamente 70 casos no mundo todo

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Duas formas da doença

• Moderada
• Causada por uma deficiência GS limitada aos
  eritrócitos, resultando em anemia hemolítica
  crônica e icterícia neonatal.

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Grave
Glutamilcisteína
GS
Glutamil ciclotransferase
Avaria de inibição por feedback -
5-oxiprolina cisteína
5-oxiprolinase
Acumulo de oxiprolina em tecidos corporais ? Leva
a 5 oxoprolinuria e acidose metabólica
Muitos pacientes que sofrem da forma grave da
doença são mentalmente retardadas e alguns
apresentam distúrbios da função motora
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(No Transcript)
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Localização

• Localizado no Cromossomo 20q11.2 e contém 12 éxons

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Caracterização do Gene

• O gene foi mapeado na região 20q11.2 através de
  FISH (Hibridação in situ por fluorescência)
• Doença autossômica recessiva
• Constituído de 12 éxons
• Duas regiões não traduzidas uma 3 e uma 5
• Tem aproximadamente 23 Kb de tamanho

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Caracterização do Gene

• Para detecção de mutações foi utilizado
  PCR(Reação em cadeia da polimerase) e
  sequenciamento das amostras.
• Também foram analisadas regiões flanqueadoras
  (éxon/intron) através de sequenciamento

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Caracterização do Gene

• Para produção do cDNA foi usado RT-PCR com RNA
  extraído de fibroblastos do Rim.
• Devido as mutações promoverem a criação de sítios
  de restrição para enzimas específicas, foi
  possível o uso de RFLP.

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Modelo de expressão

• Foram utilizados dois modelos de expressão a
  Levedura S. pombe(Schizosaccharomyces Pombe) e a
  bactéria E. coli para avaliação da atividade das
  enzimas mutantes.

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Detecção das mutações
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Detecção das mutações
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Efeitos estruturais da mutação em pacientes com
deficiência da glutationa sintetase
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(No Transcript)
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Métodos

• Clonagem da região 5 flanquiadora do gene GSS
  de humanos
• Usando 5'-RACE (amplificação rápida de
  extremidades do cDNA) análise, para determinar o
  sítio de iniciação transcricional em células
  Chang (linhagem de células humanas do fígado)

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Métodos

• Construção 5'- construção de deleções
• Mutagênese proximal e distal sítios NFE2 no
  promotor GSS humanos
• Análise da construção de promotores em cultura de
  células Chang
• Análise Northern Blot

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Métodos

• EMSA (ensaio mudança mobilidade eletroforética)
• CHIP (imunoprecipitação de cromatina) análise

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(No Transcript)
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Tratamento

• Vitamina C 100 mg/kg/dia
• Vitamina E 10mg/kg/dia
• Bicarbonato Correção da acidose
• N-ACETILCISTEÍNA ? Neurotóxica

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Alcaptonúria
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Etiologia.

• Causada pela falha na atuação da enzima
  homogentistato-1,2 dioxigenase.
• Causa um acúmulo de ácido homogentístico, o qual
  é eliminado na urina, é oxidado no ar e deixa a
  urina escurecida.
• Tecidos conectivos ficam com uma cor azulada ou
  negra devido ao acúmulo do metabólito.

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Pigmentação característica
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Gene HGD

• Codifica para a enzima homogentistato-1,2
  dioxigenase, a qual participa do metabolismo de
  aminoácidos como a fenilalanina e tirosina, a
  qual atua principalmente no fígado e nos rins.
• É constituído por 14 éxons.

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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Estudos moleculares

• O gene foi clonado por Fernandez-Canon a partir
  da sequência de um gene similar, hmgA, encontrado
  no fungo Aspergillus nidulans .
• O gene foi mapeado com o uso de PCR e de FISH
  (Fluorescent In Situ Hibridization) na
  região 3q.13.33.

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Mutações

• Fernandez-Canon identificaram mutações de sentido
  contrário relacionadas a casos da doença.
• Gerhig estudou dois casos em que os pacientes
  possuíam uma substituição A-G com subseqüente
  substituição de uma glicina por uma arginina.

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• Os pacientes que são homozigóticos para a mutação
  apresentavam a doença.
• Outros dois pacientes possuíam uma inserção que
  causava uma parada prematura da transcrição.
• Pacientes com heterozigozidade não apresentavam
  sintomas, comprovando a característica recessiva
  da doença

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(No Transcript)
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Hot spots

• Em 1999, Beltran de Bernabe, descobriu dois novos
  polimorfismos e concluiu que as repetições de
  nucleotídeos CCC são hot spots, visto que
  mutações nestes pontos são encontrados em mais de
  30 dos casos.

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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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• Rodriguez et al. (2000) ao estudarem mutações que
  afetavam a conformação final da proteína se
  utilizaram da bactéria E. coli como modelo de
  expressão.

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• Foram utilizados vetores plasmidiais para a
  transformação da bactéria e o meio de cultivo
  continha ampicilina e cloranfenicol, cujo
  objetivo era de selecionar os microrganismos que
  receberam o plasmídio.

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• Também foi feita uma analise de mutações no gene
  do fungo Aspergillus nidulans.
• Foi utilizado um meio contendo fenilalanina, a
  qual, ao não ser metabolizada pelos organismos
  mutantes permite a distinção das colônias.

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• As colônias mutantes são distinguíveis pelos
  pigmentos ocronômicos.

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• O DNA foi clonado por PCR (reação em cadeia da
  polimerase).
• O produto da PCR foi analisado através do
  sequenciamento direto.
• As linhagens mutantes foram cruzadas com
  linhagens normais, sendo que menos de dois por
  cento da progênie tinha o fenótipo mutante.

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Diagnóstico

• O diagnóstico é feito de forma clínica, através
  da análise do paciente ou através de análises
  sanguíneas ou de urina
• Existem empresas que fazem a análise molecular,
  incluindo uma que faz análises pré-natal.

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(No Transcript)
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Referências

• http//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/607474
• http//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8782815
• http//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9069115
• http//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9154114
• http//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9529363
• http//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10205262
• http//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11001939

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OBRIGADO