Eiwitzuivering 2

1
Eiwitzuivering 2

• Kwantificeren van eiwitten
• PAGE en SDS-PAGE
• Iso-electric focussing
• 2D PAGE

Sigrid Beiboer en Ivo Horn
TBEMH-P05IDB HC6
2
Kwantificering

• OD280 of A280
• Kleuring door complexvorming

• Spectrofotometrische bepalingen
• waarden tussen 0,1 en 1,0!!!!!!!!!!!!
• blanco stellen met buffer

3
Kwantificering, OD280

• Eiwit absorbeert specifiek bij 280 nm
• Tyr en Trp en in mindere mate Phe (Y, W en F)
• pH en T hebben invloed op absorptie
• Abs. 220 en lager peptideband in eiwit
• Afhankelijk van aantal az met ringstructuur!

4
Kwantificering dmv kleuring

• Meestal in mg/ml, tenzij precies de code bekend
  is (dan in molair)
• Kleuring door complexvorming, vb
• Bradford
• Biureet reactie
• Folin-Lowry
• BCA

5
Kwantificering, Bradford

• Binding Coomassie Brilliant Blue G-250 aan eiwit
• Rood, na binding in zuur milieu blauw
• Meting bij 595 nm
• Bindt niet i.a.v. bepaalde detergentia, bijv
  deoxycholaat, triton X-100, NP-40

6
Kwantificering, Biureet reactie

• Koperionen binden aan peptidebanden
• Reductie Cu2 naar Cu
• OD545
• Onafhankelijk van soort aminozuren

7
Kwantificering, Folin-Lowry

• Biureetreactie gevolgd door reductie van
  fosfomolybdaat door Y, W, C, H en peptidebanden
• Blauwe kleur bij 745 nm
• Zeer nauwkeurig

8
BCA bepaling

• Principe gelijk aan Lowry
• Door bicinchoninic acid veel gevoeliger
• Minder gevoelig voor detergentia
• OD562 en lineair tot OD5622

9
Elektroforese, scheiding van eiwitten
Moleculaire zeef in gel
10
PAGE polyacrylamide gel elektroforese
Polymerisatie van acrylamide met N,N-methyleen
bisacrylamide mbv katalysator
11
Percentage crosslinker (bisacrylamide)

• Crosslinks bepaalt mechanische eigenschappen
  gel en gemiddelde diameter van de poriën
• Meestal stockoplossing van acrylamide
  bisacrylamide 29,2 0,8
• Stockoplossing wordt gefiltreerd (0,4 um) en in
  donker bij 4ºC bewaard

poriediameter
12
Percentage totaal acrylamide

• Marker
• Myosin, 205 kDa
• Beta-galactosidase, 116 kDa
• Phosphorylase, B 92 kDa
• BSA, 66 kDa
• Egg albumin, 45 kDa
• Carbonic anhydrase, 29 kDa

www.ruf.rice.edu/bioslabs/studies/sds-page/rf.htm
l
(Dalton is gewicht proton)
Grote eiwitten laag percentage acrylamide Kleine
eiwitten hoog percentage acrylamide
13
Katalysatoren

• 10 ammoniumpersulfaat (10 APS, bij -20ºC
  bewaren) en N,N,N,N-tetramethyleendiamine
  (TEMED, donker bewaren bij 4ºC)
• Aard van katalysator heeft invloed op
  poriediameter
• Concentratie van katalysator heeft invloed op
  structuur van de gel

14
Continue buffersysteem

• 1 gel, 1 buffer
• Geen concentrering van eiwitten, dikkere bandjes
• Kan een beetje voorkomen worden door
• sucrose vlak voor monster oplading op de gel op
  te brengen
• kleinere ionen uit het monster te halen (dialyse)
• Betere scheiding door eerst met laag voltage en
  later met hoog voltage te elektroforeren

15
PAGE met discontinue pH

• Een discontinu systeem bestaat uit 2 gellagen
• Stacking gel 3 acrylamide, gel met grote
  mazen. Monster wordt
• geconcentreerd en eiwitten gerangschikt naar
  hun mobiliteit
• Separation / running gel 10 acrylamide, gel
  met kleine mazen,
• waarin scheiding plaats vindt

Tris Glycine- pH 8,3 Elektrodevat
Tris Cl- pH 6,8 Stacking gel
Tris Cl- pH 8,8 Running gel
Kathode
Anode
Glycine pK aminogroep 9,8 pK carboxylgroep
2,4 IEP (9,8 2,4)/2 6,1
16
Buffers met verschillende pH regelen de
mobiliteit van de elektrolyten

• pH monsterbuffer en stacking gel zijn gelijk
  (6,8)
• IEP van glycine is 6,1 geringe negatieve
  nettolading
• traagste elektrolyt in stacking gel
• Kleine Cl- ion is leidend elektrolyt
• Hiertussen liggen de mobiliteiten van de
  eiwitten
• Rangschikking van eiwitten naar mobiliteit
• Eiwitzones concentreren zich

• Grensvlak stacking en running gel toename pH
  tot 8,3 van elektroforesebuffer
• Running gel heeft kleine poriën en lage
  potentiaalgraad
• migratiesnelheid van eiwitten neemt sterk af
• Glycine bij grensvlak - toename in dichtheid
  running gel
• - pH stijging naar 9,5 (glycine wordt sterk
  negatief)
• - mobiliteit van glycine neemt sterk toe
• Scheiding van eiwitten door moleculaire
  zeefwerking

17
SDS-PAGE

• SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate - Poly
  Acrylamide Gel Electrophoresis (Laemmli)
• SDS geeft eiwitten een negatieve lading
• Scheiding van eiwitten op molecuulmassa
• Molecuulmassa bepaling van eiwitten mbv marker
• Indicatie aantal en hoeveelheid van eiwit
  (subeenheden) in een monster

18
PAGE van IgG moleculen (antilichamen)

• Totaal 150 kDa
• 2 zware ketens van elk 50 kDa
• 2 lichte ketens van elk 25 kDa
• (1 dalton massa 1 proton)

• Bevat zwavel bruggen tussen
• de zware ketens
• de zware en lichte ketens

• Natieve PAGE een brede zone
• SDS-PAGE een bandje van 150 kDa
• SDS-PAGE DTT 2 bandjes van 25 kDa en 2
  bandjes van 50 kDa

19
SDS-PAGE van IgG moleculen
20
SDS-PAGE
Biorad minigel systeem
21
Gieten van de gel en runnen
SDS PAGE op youtube
Pouring the gel
http//www.youtube.com/watch?vEDi_n_0NiF4feature
fvw
Running the gel
http//www.youtube.com/watch?v5eMsgidAY5Efeature
related
22
Gel cassette in elkaar zetten
23
Gieten van de gel
24
Elektroforese cassette
25
Monster laden op gel
Sample buffer bevat de volgende stoffen

• Broomfenolblauw hoge mobiliteit, detecteert
  migratie bufferfront
• Glycerol eiwitdaling in slotje
• SDS
• Tris buffer pH 6,8

26
Elektroforeren
Gel wordt gerund bij 40 mA of 100 V
27
Fixatie en kleuring
Fixatie om bandverbreding door diffusie tegen te
gaan

• Kleurmethoden
• Coomassie Brilliant Blue R250 (CBB), hergebruik
  mogelijk
• CBB in water/methanol/ijsazijn (detectiegrens is
  0,2-0,5 ug eiwit)
• Snellere, groffere, slechtere kleuring CBB in
  trichloorazijnzuur
• Ontkleuring met isopropanol of methanol in
  azijnzuur
• Zilverkleuring
• 10 tot 100 x gevoeliger dan CBB
• Kleuring niet voor alle eiwitten lineair met
  concentratie
• Fluorescerende labels aan eiwitten gekoppeld
• Radioactieve labels aan eiwitten gekoppeld
• Immunologische detectie (Western blot)
• Detectie van enzymen (in H05PBM
  4CIN/waterstofperoxide oplossing ? toont alleen
  peroxidase enzym aan)

28
Resultaat coomassie kleuring
29
Resultaat zilverkleuring
30
Overige kleuring manieren
Radioactiviteit
4CIN/waterstofperoxide oplossing toont
peroxidases uit verschillende groenten (H05PBM)
31
Vraagje

• Welke moleculen uit een cel kunnen worden
  gedetecteerd op SDS-PAGE?
• Alleen eiwitten van interesse
• Alle eiwitten
• Zowel eiwitten als DNA
• Alles eiwitten, DNA en overig celmateriaal

32
Isoëlektrisch punt, IEP of pI
pH waarbij nettolading van eiwit nul is
IEP of pI is afhankelijk van -
aminozuursamenstelling - volgorde van aminozuren
33
Isoëlektrische focussering

• pH gradiënt over gel aangebracht
• Samples worden op gel geladen
• pH op opbrengplek
• pH gt pI eiwit eiwit negatief migreert naar
  positieve anode
• pH lt pI eiwit eiwit positief migreert naar
  negatieve kathode
• Migratie van eiwit stopt op die plek waarbij pH
  pI
• Marker mee om pI te bepalen

34
Instelling gradiënt
Anode 6H2O O2 4H3O 4e- Kathode 4H2O
4e- 2H2 4OH-
Verschillende amfolyten worden op gel gebracht
Kathode
Anode



-
-
-
Elektroforese gradiënt stelt zich
in lineaire pH gradiënt
35
pH bereik
Scherpe pH-overgangen aan uiteinden van de
gel bereik van gradiënt komt niet overeen met
pH-waarden van de elektrode oplossingen
36
Aandachtspunten

• Amfolytconcentratie gt 2
• Amfolyten mogen niet meekleuren
• zonodig verwijderen met 5 TCA
• Spanning (V) zo hoog mogelijk instellen na
  instelling pH gradiënt, runnen op constant
  vermogen (bijv. 30 Watt)

37
Voorbeeld Isoëlektrische focussering
38
2D-elektroforese
1. Isoëlektrische focussering 2. SDS-PAGE
39
Resultaat 2D-elektroforese
Via http//us.expasy.org en SWISS-2DPAGE nog meer
40
Welk eiwit?

• Marker nodig
• Afstanden meten schatten visueel
• Computer software
• Internet database
• Vergelijkbare 2D gels

myoglobine
PC, database
41
Bepaling molmassa of pI mbv afstanden meten
42
(No Transcript)
43
(No Transcript)
44
(No Transcript)
45
(No Transcript)
46
Wilson Walker, Campbell Farrell

• 7e editie
• H5 5.1-5.3
• H5 5.4 lezen

• 7e editie
• H3 3.1-3.4.2
• H8 8.1-8.3.4
• H10.2.2-10.3.5 10.3.7
• H1111.1.1-11.1.2, 11.2.1-11.2.2,
• 11.6-11.8.2 11.8.4

WW H11 gaat over chromatografie, wat in IDB HC7
wordt behandeld