G

1
Génexpresszió szabályozása szintetikus
oligonukleotidokkal

2
Triplex képzodésének kölcsönhatásai
homopurin homopirimidin szekvenciáknál
3
Antiszensz oligonukleotidok lehetséges
célszekvenciái a mRNS-en

• exon-intron határhoz, slicing gátlás
• Az 5 sapka régióhoz
• Transzlációs iniciációs régióhoz
• Génen belüli régióhoz
• Kapcsolódó oligonukleotidok

Elsodleges hatásmechanizmus Az endogén RNázH
leemészti a DNSRNS hibrid RNS szálát
4
Oligonukleotid szintézisfoszforamidit módszer
B
1
B
1
O
O
O
O
A
c
O
di-MeO Tr
O
2 DCA/DCM
O
O
di-MeO Tr
hordozó
hordozó
lt 1
B
2
O
O
tetrazol
di-MeO Tr
O
N
újabb ciklus
O
P
N
N
C
O
gt 99
B
2
B
2
O
O
O
di-MeO Tr
O
O
I
/ H
O
B
2
2
1
di-MeO Tr
O
O
B
O
1
O
O
O
P
O
O
N
C
O
O
P
O
O
N
C
O
O
hordozó
hordozó
5
Oligonukleotid szintézisfoszforamidit módszer
B
1
B
1
O
O
O
O
A
c
O
di-MeO Tr
O
2 DCA/DCM
O
O
di-MeO Tr
hordozó
hordozó
lt 1
B
2
O
O
tetrazol
di-MeO Tr
O
N
újabb ciklus
O
P
N
N
C
O
gt 99
B
2
B
2
O
O
O
di-MeO Tr
O
O
I
/ CS2
B
2
1
di-MeO Tr
O
O
B
O
1
O
O
O
P
O
O
N
C
S
O
P
O
O
N
C
O
O
hordozó
hordozó
6
Oligonukleotid szintézis H-FOSZFONÁT MÓDSZER
H lehet Me is
Elony az oxidációt elég a végén elvégezni,vagy
igény szerint el sem kell ? töltés nélküli
molekula ? Könnyebben átmegy a sejtfalon/membránon
7
PEPTID NUKLEINSAVAK (PNA)
Nincs cukorfoszfát gerinc, ehelyett peptid
kötéssel összekapcsolt lánc van Specifikus Stabil

PNA T10-Lys TTTTTTTTTT-Lys PNA SV40-Lys ATTTTCTTCA
TTTTTTCTTC-Lys Ma már külön könyv van a PNA-
alkalmazásairól
8
MUTAGENEZIS
- in vivo gének elrontására,vagy módosítására

• Random mutagenezis
•  
• találomra létrehozott mutációk
• mutagén anyagok UV, kemikáliák, radioaktív
  sugárzás
• PCR a hostabil polimerázok átírási husége
  rosszabb
• mutagén törzsek
• transzpozon mutagenezis
•  

Irányított mutagenezis Adott helyen - deléciók
inszerciók léterhozása - pont mutációk
létrehozása
9
Gének irányított szétroncsolása interpozon
mutagenezis
Ar1
oriV
oriT
oriV szuk gazdaspecificitás
Ar2
Ar antibiotikum rezisztencia
Ar1
Ar2
ori
oriT
Ar2
vad típus
mutáns
poláris hatás
10
Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése
nélül
Ar1
oriV
oriT
oriV szuk gazdaspecificitás
Ar antibiotikum rezisztencia
Ar1
ori
oriT
vad típus
mutáns
poláris hatás ?
11
Gének irányított mutagenezise a dut/ung rendszer
alapján
pontmutációk!
Dut dUTPase Ung uracil-N-glikoziláz Ne
épüljön be dezoxiuracil A DNS-be
in vitro szintézis, Klenow
12
QUICK CHANGE MUTAGENEZIS (STRATAGENE)
13
FEHÉRJE TERMELTETÉS
VAN GÉNÜNK
Legyen az prokarióta vagy eukarióta természete
s vagy szintetikus vad típusú vagy mutáns
14
FEHÉRJE TERMELTETO RENDSZEREK
PROKARIÓTÁK
E. coli   ismert, Bármilyen fehérje, feltéve,
ha - nem túl nagy - nem túl kicsi - nem túl
hidrofób - nincs túl sok cisztein benne
szekréciós rendszere minimális
Bacillus subtilis   jól ismert, ha nem is
annyira, mint az E. coli van szekréciós
rendszere
EUKARIÓTÁK

• emlos sejtvonalak
•  
• minden fajta fehérje termeltetheto bennük
• tranziens expressziós rendszerek viszonylag
  gyors, de korlátozott lehetôségek,
• stabil expressziós rendszerek
• hosszú, fáradságos optimalizálást igényel

• éleszto
•  
• gyorsan szaporodó eukarióta sejtvonal,
• sok ismeretanyag
• viszonylag könnyu kezelhetoség
• poszttranszlációs modifikációk lehetosége

15
Escherichia coli

• ELONYÖK ?
• óriási mennyiségu ismeretanyag
• könnyu kezelhetoség, gyors növekedési sebesség,
  viszonylag olcsó médium
• nagy mennyiségu biomassza gazdaságos eloállítása
• ismert szelekciós rendszerek
• legtöbb expressziós rendszer

• HÁTRÁNYOK ?
• általában nem szekretál
• a sejten belül redukáló atmoszféra diszulfid
  hidakkialakulása gátolt
• az eukariota poszttranszlációs módosítások
  általában nem megvalósíthatóak
• nem alakul ki a megfelelo aktiv szerkezet, rossz
  folding

16
STRATÉGIÁK TÚLTERMELTETÉSRE
KONSTITUTÍV PROMÓTER
INDUKÁLT TERMELTETÉS

• a fehérje a teljes növekedési fázis alatt
  expresszálódik
• nagy sejttömeg elérése után a fehérje
  visszanyerése
• nem igazán használatos, toxicitási problémák miatt

• a promoter represszált állapotban van a növekedés
  egy bizonyos fázisáig
• valamilyen indukcióval derepresszió
• további növesztés
• fehérje visszanyerése
• legáltalánosabban használt stratégia
• toxicitás sok esetben megoldható

17
PROKARIÓTA EXPRESSZIÓS VEKTOR ELEMEI
SZF
GS
?
Pr
TT
-35 -10
SD
kódoló szekvencia
STOP kodon UAAU UGA UAG
-10
-35
TTGACAN17TATAAT
START kodon AUG GUG UUG
5 UAAGGAGGN(3-11)
AR
ORI
Pr promóter TT transzkripciós terminációs
szignál, SZF szabályozó fehérje,, TSZE
transzlációt szabályozó elemek, SD
Shine-Dalgarno szekvencia,
AR antibiotikum rezisztencia, ORI replikációs
origo GS gazdasejt
18
A génexpresszió szabályozása
FEHÉRJE
RNS
DNS
transzripciós szinten
poszt-transzkcripciós szinten (mRNS degradáció,
protein stabilitás, stb.)
19
Különbözo faktorok relatív hatása a fehérje
termeltetésre E. coli-ban

• Promóter indukálhatóság kb. 1000 x
• Gazdasejt kb. 1000 x
• A mRNS 5 struktúrája kb. 100 x
• Transzláció kb. 100 x
• növekedési sebesség kb. 50 x(mRNS stabilitás)

20
túltermeltetésnél ne legyen nagyon magas a
kópiaszám ? toxikus fehérjék alapexpressziójának
visszaszorítása
Runaway plazmidok indukálható kópiaszámú
plazmidok
21
(No Transcript)
22
TRANSZKRIPCIÓ

• Iniciáció
• fehérje termeltetés során a legfontosabb
• Elongáció mivel a gén belsejében van, nem
  manipulálható
• Termináció a transzkripció befejezése, a
  transzkripciós apparátus túlterhelésének
  elkerülésére

23
A transzkripció iniciációja prokariótákban
sigma faktor
holoenzim
RNS polimeráz
RNS polimeráz alegységek ?, ?, ?, ?,
?
promóter
5
3
5
3
k1
k-1
Ha k1 gtgt k-1, akkor a polimeráz holoenzim
nagyon erosen kötodik a promóter szekvenciához, a
polimeráz nehezen tudja elindítani a
polimerizációs reakciót. Tehát a transzkript
mennyisége csökken, habár in vitro a promóter és
a holoenzim közötti kapcsolat eros.
k2
k-2
3
5
5
24
?70 promoter szekvencia -10 and -35 régiók
25
A tökéletes ?70-függo promóter
1
-10
Ext.
-35
UP elem
D
AAATAAAATTTTTAAn..nTTGACAnnnnnnTGnTATAATnnattA
14nt
4-6nt
4-6nt
17nt
A s70 ismeri fel
Az a alegység kötodik
26
Bakteriális ? faktorok
27
Különbözo gének expresszióját különbözo szigma
faktorok befolyásolják
tápelvonás, Stressz, Vasra éheztetés,
sejtsuruség, Felületi adházió
Transzkripciós faktorok (Szigma)
gén expresszió változás ? Morfológiai
fiziológiás változások ? ? Adaptáció / Védekezés
28
Két ? faktor felépítése
29
A génexpresszió tanulmányozása különbözo
módszerekkel különbözo szinteken
30
ELECTRO MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) I.

• más néven gél retardációs assay
• a DNS-t, amely feltételezhetoen fehérjét köt,
  megjelöljük
• jelölés lehet végen, szálon belül, egyszálon,
  kétszálon, kötési kísérletben a DNS kétszálú!
• a DNS ne legyen tol hosszú 20-200 bp, minél
  hosszabb a DNS, annál több nem specifikus reackió
  történik
• lehet tiszta fehérje vagy fehérje populáció

Natív poliakrilamid gél- fehérje nélkül,
fehérjével összekeverve
DNS
-
-
jelölés
DNS köto fehérje
nem kötodik
kötodik
összekeverés
-
nem kötodik
kötodik
nem specifikusan kötodik
31
ELECTRO MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) II.

• a mobilitás eltolódás inkább a komplex méretét
  jellemzi, a kölcsönhatás errosségét nem
• a kölcsönhatás erosségét a nem kötöt DNS, és a
  kötésben levo DNS jelének intenzitása
  jellemziminél kevesebb fehérje okoz eros jelet
  az eltolódott sávban annál erosebb a kölcsönhatás

SUPERSHIFT ASSAY
titrálás fehérje mennyiségre

• ha van tippünk, hogy milyen fehérje kötodik
• és van rá specifikus ellenanyagunk

hozzáadott fehérje mennyiség no ?
-
nem kötodik
kötodik
ellenanyag is kötodik
-
a DNS - fehérje kölcsönhatás erosségérol ad
felvilágosítást, nem a képzodött mRNS
mennyiségérol
- fehérje nélkül, csak fehérje hozzáadása,
fehérje és ellenanyag hozzáadása
32
DNázI FOOT PRINT I.
DNS hossz 100 200 bp DNS jelölés szigorúan a
végén, szálspecifikusan mind a két jelölt
szállal meg kell csinálni a kötési kísérletben a
DNS kétszálú
denaturáló poliakrilamid gélelektroforézis
Maxam-Gilbert létra
DNázI hasítás
G AG CT C D

33
DNázI FOOT PRINT II.
DNázI hasítás- fehérje nélkül fehérje
jelenlétében
Maxam-Gilbert létra
G AG CT C D- D
hiperszenzitív hely (HSH)
DNázI
HSH
34
METILÁCIÓS INTERFERENCIA
DNS jelölés szigorúan a végén, szálspecifikusan
a DNS-t Maxam-Gilbert szerint dimetilszulfáttal
(DMS) metiláljuk mind a két jelölt szállal meg
kell csinálni a kötési kísérletben a DNS kétszálú
denaturáló poliakrilamid gélelektroforézis
piperidinhasítás MeG-nél
Maxam-Gilbert létra
G AG CT C G
G
G
G
G
piperidin
DMS
G
G
G
Me
G
csak a jelölt szálon szemléltetve
35
METILÁCIÓS INTERFERENCIA II.
piperidinhasítás MeG-nél
Maxam-Gilbert létra
modell
PM és NKmintázat
K mintázat
G AG CT C PM K NK
tegyük fel, hogy ezek a G-k esszenciálisak a
kötéshez
DMS
EMSA
-
?
K kötött
NK nem kötött
kivágás, izolálás
?
piperidin hasítás
?
denaturáló PAGE
PM protein mentes
36
UV KERESZTKÖTÉS (CROSS LINKING)
Ismeretlen DNS köto fehérjék molekulatömegének
becslésére 1. A DNS szálat szálon belül jelöljük,
és Br-dUMP-t építünk be (a Br-dUMP nem
zavarja a kötodést)
minta marker
Br
SDS-PAGE
jelölt fehérje
DNázI kezelés
?
?
EMSA
UV fény
kivágás, izolálás
?
a fehérje DNS komplex kötés kovalens lesz
37
A mRNS mennyiségének meghatározása

• Northern-blot és hibridizáció
• reverz-transzkripció kapcsolt kvantitatív PCR
• korrekt, de belso összehasonlító standardokat
  igényel
•  

38
In vitro transzkripció
Regulátor G mentes kazetta régió
(3-400 bp)
Promóter
a képzodött radioaktív RNS analizise denaturáló
PAGE-n. csak a fenti 3-400 bp-os fragmentum fog
látszani, a többi tartalmaz G-t ? ezek
transzkirpciója leáll mennyiségi becslés
denzitometriásan, vagy PhosphorImager-rel
elsosorban transz szabályozó elemek hatásának
vizsgálatára alkalmas
39
Riporter gének alkalmazása
Regulátor régió riporter gén
(pl. lacZ)
Promóter
SEJT
?-galaktozidáz (LacZ)
?-galaktozidáz aktivitás mérés
feltételezi, hogy nincs poszt-transzkripciós
szabályozás, és az enzim specifikus aktivitása
is minden mintára egyforma aktivitás mérés
kiküszöbölése GFP Green Fluorescent Protein,
gerjesztve floureszkál a kapott aktivitást
illetve szignált normálni kell a sejt vagy
protein mennyiségére