Izolovanje i preci

1
Izolovanje i precišcavanje enzima
2

• Zašto izolujemo enzime?
• Strategija precišcavanja
• - maksimalna precišcenost
• - maksimalni prinos
• - maksimalno sacuvana aktivnost
• Izvor enzima
• - obilnost
• - dostupnost (ekonomska, geografska, eticka)
• - komparativne studije (izoenzimi)
• - lokalizacija
• Ekstrakt (homogenizacija, ili precišcavanje
  organela homogenizacija)
• Sirovi preparat (large-scale separacija)
• Cist enzim (small-scale separacija, ili
  afinitetna hromatografija direktno iz ekstrakta)

3
(No Transcript)
4
Faze u izolovanju

• Zahtevi za cistocom se definišu prema konacnoj
  upotrebi preparata
• 1. vrlo visoka (99 i više) terapeutska
  primena, in vivo studije
• 2. umereno visoka (95-99 ) x-ray
  kristalografija, karakterizacija
  fiziko- hemijskim metodama
• 3. umerena izolovanje antigena za proizvodnju
  antitela, N-terminalno sekvenciranje
• Identifikujte kljucne necistoce
• Proverite stabilnost enzima (pH, jonska sila) i u
  skladu sa tim osmislite strategiju izolovanja i
  precišcavanja
• Ukoliko niste zadovoljni cistocom preparata,
  ukljucite nove korake
• Kontaminante koji mogu da inaktiviraju enzim, ili
  ga denaturišu, potrebno je ukloniti (ili
  inaktivirati npr. proteaze) što ranije iz smeše
  (najbolje vec u prvom koraku).

5
(No Transcript)
6
Osobine proteina koje se koriste tokom
precišcavanja

• Naelektrisanje Jonoizmenjivacka
  hromatografija (IEX)
• Velicina Gel filtracija (GF)
• Hidrofobnost Hidrofobna hromatografija
  (HIC), RPC
• Bioprepoznavanje Afinitetna hromatografija

7
(No Transcript)
8
(No Transcript)
9
(No Transcript)
10
Enzimi dobijeni rekombinantnom tehnologijom

• Neke proteine je izuzetno teško izolovati iz
  prirodnih izvora
• Gen (cDNA) manipulacijom DNK se ubacuje u
  odgovarajuci vektor
• Vektor se ubacuje u odgovarajuci sistem za
  ekspresiju (proizvodnju) bakterijski, biljni,
  insektni, sisarski.
• Manipulacijom na nivou cDNA, rekombinantni
  protein može da dobije ekstra aminokiseline, ili
  citave proteine (GST), u vidu fuzionog produkta,
  koji ne uticu na aktivnost, ili 3D, ali mogu da
  olakšaju postupak izolovanja (His tag).
• Koliko je protein dobijen rekombinantnom
  tehnologijom slican (identican) prirodnom
  proteinu?
• Karakterizacija...
• Primena...

11
Primer postupka precišcavanja rekombinantnog
enzima

• Deacetoksicefalosporin C sintetaza (rDAOCS) je
  enzim osetljiv na kiseonik. Protein je
  overexpressed u rastvornoj formi u citoplazmi
  E. coli. U prvom koraku, celije su lizirane
  mehanickom silom. Pufer za lizu je sadržavao
  inhibitore proteaza, pored ostalih komponenti
  (DTT).

12
Odredjivanje molekulske mase GF i SDS PAGE
13
Odredjivanje strukture rDAOCS
14
Afinitetetna hromatografija

• Enzim analog supstrata, inhibitor, kofaktor
• Antitelo antigen, virus, celija
• Lektin polisaharid, glikoprotein, receptor na
  površini celija, celija
• Nukleinska kiselina komplementarni lanac,
  histoni, NK polimeraze, NK vezujuci proteini
• Hormoni, vitamini receptor, transportni protein
  (nosac)
• Glutation Glutation-S-transferaza ili GST
  fuzioni proteini
• Joni metala Poli(His) fuzionisani proteini,
  proteini bogati His, Cys, Trp ostacima na
  površini

15
Protein Vrsta kolone
GST fuzionisani proteini GSTrap FF
Albumin i enzimi koji vezuju nukleotide HiTrap Blue HP
Protein i peptidi sa izloženim His, Cys ili Trp ostacima (kao i (His)6 fuzionisani proteini HiTrap Chelating HP
DNK vezujuci proteini i koagulacioni faktori HiTrap Heparin HP
Tripsinu slicne proteaze (Faktor Xa, trombin i tripsin) HiTrap Benzamidine FF
16
(No Transcript)
17
(No Transcript)
18

• Precišcavanje enzima onovni problemi i postavke
•  
• -         Neophodan je odgovarajuci test enzimske
  aktivnosti
• -         Odgovarajuci test za odredjivanje
  koncentracije proteina
• -         Definicije specificna aktivnost,
  prinos, stepen precišcenja, broj izmena
• -         Dnevnik postupka izolovanja i
  precišcavanja (zapremina, conc., akt.)
• -         Izbegavati one korake koji daju slab
  prinos i mali porast u cistoci
• Neke osnovne definicije
• Jedinica aktivnosti (1 U) Ona kolicina enzima
  neophodna za katalizu reakcije transformacije 1
  mikromola supstrata po minuti pri standardnim
  uslovima.
• 1 Katal 1 mol supstrata u 1 s
• Primer Ako 0,1 mg/mL enzima katalizuje
  konverziju 10 mikromola substrata po minutu, tada
  u 1 mL ima 10 jedinica aktivnosti. Specificna
  aktivnost ovog rastvora ce biti 100 U/mg
  proteina.
• Standardni uslovi oni koji odgovaraju datom
  enzimu (pufer, prisustvo kofaktora etc). Odnosno,
  kad god je moguce
• -         Temperatura 30 oC
• -         pH optimum za dati sistem Enz-Sub
• Koncentracija substrata na 10x poluzasicenja
  substratom (10 Km)

Brzina promena koncentracije reaktanata u
vremenu. Reakciona brzina koja se odredjuje u
kinetickim eksperimentima odgovara pocetnoj
brzini reakcije (vi, vo). Sprecava se efekat
povratne reakcije, inhibicija proizvodom se svodi
na minimum.
19

• - Poluzasicenje
•  
• -         Brzina enzimske reakcije postiže
  zasicenje kada je koncentracija substrata toliko
  visoka da su sva aktivna mesta zauzeta
  (maksimalna brzina Vmax).
• -         Poluzasicenje enzima substratom je ona
  konc. substrata kada se postiže 50 Vmax (Km
  merilo afiniteta enzima za odgovarajuci substrat)
• Poznavanje vrednosti Km za dati sistem je moguce
  ukoliko se poznaje Vmax ili nakon serije
  eksperimenata za odredjivanje brzine za razlicite
  konc. substrata i fitovanja tih podataka u
  jednacinu koja opisuje oblik ove krive prema
  nepoznatim vrendostima (Km i Vmax).  
• Koju jednacinu koristiti...
•  
•  
•  
•  
•  
•  
•  
• Nekoliko hemijskih kinetickih modela
• daje slicne jednacine oblika Y aX/(bX)

20

• Analitika proteina
•  
• Elektroforetske tehnike
•  
• -         Nativna elektroforeza
• -         Elektroforeza u prisustvu uree
• -         SDS PAGE
• -         Gradijentni gelovi
• -         Izoelektrofokusiranje
• -         Dvodimenzionalne elektroforeze
• -         Kapilarna elektroforeza
•  
• Detekcija nakon elektroforetskog razdvajanja
•  
• -         Proteini (CBB, Ag)
• -         Glikoproteini (Šifovo bojenje)
• -         Antigeni (uz odgovarajuce antitelo,
  najcešce nakon transfera na membranu imunoblot)
• -         Enzimi kao i nakon hromatografskih
  razdvajanja, uglavnom podrazumeva nativne uslove
  tj. tehnike separacije koje zadržavaju korektnu
  tercijernu strukturu proteina/enzima

SDS PAGE proteina ekstrakta ploda kivija (levo
neredukujuci uslovi, desno redukujuci)
21

• Detekcija enzimske aktivnosti nakon
  elektroforetskog razdvajanja
•  
• -         Sa solubilnim supstratom podrazumeva
  prethodnu eluciju proteina iz gela (zametna i
  neprecizna tehnika)
• -         Sa precipitirajucim supstratom koji
  daje proizvod koji se može detektovati (u gelu
  ili na membrani) enzim nativan ili renaturisan
• Tehnika zimograma (za proteoliticke enzime)

Aktininidin razvojen 2D PAGE i detektovan
tehnikom zimograma
Aktinidin detektovan bojenjem CBB-om, nakon 2D
PAGE u razlicitim uzorcima ekstrakta ploda
kivija.