Pr

1
Cours d'Hémato-cytologie DUT ABB
4- automatisation de l'Hémogramme
Auteur Bruno Flamand, IUT de Dijon
2
CYTOLOGIE HEMATOLOGIQUE
LHEMOGRAMME englobe -les numérations des
éléments figurés -le dosage de
lHémoglobine -la mesure de lHématocrite -le
calculs des constantes érythrocytaires et
plaquettaires -létablissement de la formule
leucocytaire Prélèvement sang veineux sur EDTA
(ou citrate de Na), éventuellement sang
capillaire LHémogramme est automatisé
complètement ou partiellement dans les
laboratoires
3

• Numérations GR, GB, Plaquettes.
• Valeurs et constantes
• -érythrocytaires
• -Taux Hémoglobine sanguin Hb
• -Hématocrite Ht
• -Volume Globulaire Moyen VGM
• -Concentration Corpusculaire Moyenne en Hb CCMH
• -Taux Corpusculaire Moyen en Hb TCMH
• -Indice de Distribution des Rouges IDR
• -plaquettaires
• -Thrombocrite THT
• -Volume Plaquettaire Moyen VPM
• Indice de Distribution Plaquettaire IDP

4

• Formule leucocytaire répartition des différentes
  sous-populations de leucocytes PN, PE,PB,L,M
• -FL manuelle par lecture microscopique de frottis
  coloré au MGG (100 à 200 leucocytes répertoriés),
  si anomalie de FL automatisée
• -FL automatisée (5000 à 10000 leucocytes
  répertoriés)
• Les résultats sont rendus en valeur relative et
  en valeur absolue par mm3, mais linterprétation
  nest valable que sur les valeurs absolues

LHémogramme NFS Numération Formule
(leucocytaire) Sanguine

• GR, Hb, Hte,VGM,TCMH,IDR orientation du
  diagnostic des anémies
• Plaquettes diagnostic des pb dhémostase
  primaire
• GB, FL diagnostic des pb infectieux,
  inflammatoires, leucémiques

5
(No Transcript)
6
GR Homme 4,5 à 6 .106 /mm3 Femme 3,8 à 5,5 .106 /mm3
Hématocrite Homme 40 à 54 Femme 37 à 47
Hémoglobine Homme 13 à 17 g/100ml Femme 12 à 16 g/100ml
VGM 82 à 98 fl
CCMH 32 à 36
TCMH gt 27 pg
IDR lt15
Plaquettes 150 000 à 450 000 /mm3
GB 5000 à 10 000 /mm3
Granulocyte neutrophile 1500 à 7000 /mm3
Granulocyte éosinophile 0 à 400 /mm3
Granulocyte basophile 0 à 100 /mm3
Lymphocyte 1500 à 4000 /mm3
Monocyte 200 à 800 /mm3
7
Défaut Paramètres Excès
Erythropénie GR Polyglobulie
Hemodilution Hématocrite Hemoconcentration
Anémie Hémoglobine
Microcytose VGM (Normocytose) Macrocytose
Hypochromie CCMH
Hypochromie TCMH (Normochromie)
IDR Anisocytose
Thrombopénie Plaquettes HyperThrombocytose
Leucopénie GB Hyperleucocytose
Neutropénie Granulocyte neutrophile Polynucléose neutrophile
Granulocyte éosinophile Hyperéosinophilie
Granulocyte basophile Basocytose
Lymphopénie Lymphocyte Hyperlymphocytose
Monocytopénie Monocyte Monocytose
La CCMH est considérée comme un indice moins
sensible de lhypochromie que la TCMH dans les
anémies, en effet la TCMH diminue avant la CCMH
dans linstallation dun cas danémie
8
Automatisation de l'hémogramme La chronologie
par étapes
Semi Auto GB Plt VGM GR Hb Hte
Automates Numération Formule 3 pop.
Formule 5 populations
22 par. (NFS) Rétic.
Etaleur/Colorateur
7 par. - Plt
8 par. ( Plt)
18 par. (HD)
1980
1954
1972
1994
1990
2000
9
Pentra 60 Horiba-ABX
Sysmex XT
Pentra 120 Retic Horiba-ABX
ACT 5DIFF Beckman Coulter
CELL-DYN 3700 Abbot Laboratories
Coulter HMX Beckman Coulter
CELL-DYN SMS Abbot Laboratories
10
LH 1500 Series Automation Beckman Coulter
CELL-DYN WorkCell Abbott Laboratories
11
Deux principes très différents
LA NUMERATION DES TROIS LIGNEES GR, GB, PLT

• La Variation dimpédance
• Principe Coulter du nom des inventeurs (Wallace
  and Joe Coulter- 1953), Méthode de référence, la
  plus répandue. Utilisée pour les numérations, et
  la formule leucocytaire approchée.

• La mesure optique
• Associe les principes de bases de la Cytométrie
  en Flux (1977)
• -focalisation hydrodynamique
• -diffraction lumineuse recueillie à différents
  angles /incidence
• Utilisée surtout pour la numération des GB
  associée à la FL, cependant quelques automates
  utilisent la mesure optique pour les numérations
  des 3 lignées GR, GB, PLT (Bayer automate ADVIA
  120, Sysmex automate XT2000)

12
La variation d'impédancePrincipe Coulter
I constante
Electrode interne
U R I et R r l / s
Vide régulé
r résistivité et l largeur
Bac de comptage
Electrode externe
1 impulsion U 1 particule
Saphir percé dun micro-orifice
Flux de diluant conducteur
Micro-orifice, surface s
Impulsion
La valeur de limpulsion de tension U est
proportionnelle au volume cellulaire
Diamètre 4mm
13
Construction des histogrammes de distribution
volumétrique 1-amplification des impulsions (µV
en mV)2-tri des impulsions selon des seuils
électroniques3-Répartition des impulsions dans
des canaux électroniques (256 ou 128) en fonction
du niveau dimpulsion donc du volume cellulaire
4-comptage des impulsions dans un intervalle de
volume cellulaire
U f(volume cellulaire)
Histogramme de distribution volumétrique
Seuil
14
Numération des Globules Rouges et des Plaquettes
Bac de comptage des GR/PLT

• Comptage et mesure du volume à partir d'une
  suspension cellulaire diluée en solution
  isotonique taux de dilution élevé (1/10 000 à
  1/20 000 ), ce qui permet de rendre négligeable
  une interférence des GB
• Un seul bac de comptage
• Toute particule d'un volume supérieur à 25 fl (et
  inférieur à 250 fl) est comptée comme un GR
• Toute particule dun volume supérieur à 2 fl (et
  inférieur à 25 fl) est comptée comme une PLT
• Chaque particule est placée dans un histogramme
  de distribution volumétrique

15
Numération des Globules Rouges Histogramme des GR
VGM

• La trainée peut correspondre aux
• Passages en coïncidence
• Agrégats cellulaires
• Cellules agées
• Globules blancs

• Mise en évidence de fragments de cytoplasme ou de
  grandes plaquettes par l'analyse de l'histogramme
  à partir de 24 fl.

16
Numération des Globules Rouges Les paramètres
calculés

• L'IDR ou RDW (Red Cell Distribution Width)
• L'IDR est une valeur statistique correspondant au
  CV calculé sur la distribution des rouges
  coefficient d'anisocytose.

Double population
IDC Normallt 15
IDC Elevé 18
IDC très Elevé 35

• Ht Hématocrite Ht (GR 10 6/mm3 x VGM fl )
  / 10
• TCMH Teneur cellulaire moyenne en hémoglogine.
• TCMH en pg (Hb g/100 ml / Nb GR) x 10
• CCMH Concentration cellulaire moyenne en
  hémoglobine.
• CCMH en (Hb en g/100 ml / Nb GR 10 6/mm3 x
  VGM) x 1000

17
Numération des Plaquettes Histogramme des PLT et
paramètres calculés

• Le Thrombocrite
• TCT ou THT (VMP fl x Nb de Plaquettes 10 3/mm3
  ) x 1000
• L'IDP ou PDW
• Indice de distribution plaquettaire CV sur la
  distribution volumétrique des PLT coefficient
  danisocytose plaquettaire

VMP
Grandes Plaquettes gt 20 fl
Petites plaquettes, débris ? lt 2 fl
18
Numération PLT Existent des seuils
variablespermettant élimination risques
dinterférences et numérations justes
Débris Shizocytes
GR microcytaires
Grandes plaquettes
Petites plaquettes
19
Numération des globules blancs Bac de comptage
des GB

• Comptage à partir d'une suspension cellulaire
  diluée en liquide hémolytique taux de dilution
  faible, (1/200 à 1/300)
• Un bac de comptage réservé
• Toute particule d'un volume supérieur à 35 fl est
  comptée comme un globule blanc.
• Les globules rouges sont lysés (ammonium
  quaternaire, ferri cyanure, cyanure de K),
  permet la libération de Hb CyanMetHb
• Une partie de la dilution des leucocytes passe
  dans une cuve spectrophotométrique pour la mesure
  à 540 nm

Photo-détecteur
Source lumineuse LED
Filtre
Cuve de mesure
20
Correction de passage en coïncidence Doublet ou
triplet cellulaires

• Le résultat de numération est assujeti à une
  correction dite "correction de coïncidence".
• Occasionnellement deux ou trois cellules peuvent
  traverser l'orifice de comptage en même temps.
• Une impulsion de grande amplitude est générée.
• La fréquence de ces passages en coïncidence est
  statistiquement prévisible en fonction du nombre
  de cellules. Cette correction est réalisée
  automatiquement par les analyseurs.

21
LA FORMULE LEUCOCYTAIRE automatiséeTROIS
POPULATIONS ou CINQ POPULATIONS (5 Diff)

• La formule leucocytaire 3 populations ou formule
  approchée, (GRA / Lympho / Mono) pour la
  majorité des automates, elle est réalisée par
  analyse par variation dimpédance des volumes
  cellulaires des globules blancs, après lyse des
  GR, et action différentielle dune lyse ménagée
  sur les GB, lyse qui modifie leur volume.
• Cette FL approchée na pas de valeur légale, et
  très peu de valeur fonctionnelle, un automate de
  ce type décharge lautomate principal du passage
  de sangs de patients sans anomalie
• La FL complète ou 5 populations, permet en
  associant plusieurs principes technologiques,
  lanalyse des GN, GE, GB, M, L, et le repérage
  facilité de populations anormales du sang
  (lymphocytes atypiques, cellules immatures
  précurseurs, érythroblastes)

22

• Il est des circonstances où il faut effectuer
  obligatoirement une formule au microscope, et ne
  pas se contenter de la formule de lautomate
• FL du nouveau-né
• Premier examen dun malade avec nettes anomalies
  de numération
• Variations brutales et inexpliquées par rapports
  aux NF antérieures
• Incohérence avec le contexte clinique ou
  thérapeutique
• Alarmes de lautomate pour lesquelles il ny a
  pas dexplication évidente au vu du dossier et/ou
  des examens antérieurs
• Alarmes de lautomate pour distribution
  cellulaires inhabituelles sur les graphes

23
Formule 3 populationsRôle de la lyse
différentielle (Cytolyse ménagée)
La membrane devient semi-perméable Le contenu
cytoplasmique est libéré La membrane
cytoplasmique se rétracte autour du noyau et des
granulations Le volume final dépend de la taille
du noyau, de sa lobularité et des granulations.
24
Histogramme différentiel volumétrique de GB
Détermination de 3 sous-populations

• Reconnaissance des cellules d'après le volume
  résultant, par variation dimpédance
• 3 sous populations Lymphocytes, Monocytes,
  Granulocytes.
• Les anomalies de distribution sont signalées par
  des alarmes.

25
Formule Leucocytaire 5 populations

• Analyse automatisée individuelle des
  caractéristiques cellulaires naturelles ou
  modifiées dun seul leucocyte ? PERFORMANCE
• Analyse sur un nombre élevé de leucocytes (5000 à
  10000) ? PRECISION de la FL automatisée par
  rapport à FL microscopique
• Circulation des GB , après hémolyse des GR,
  individuellement, séparés, dans un système
  liquide de flux laminaire Focalisation
  Hydrodynamique ou gainage cellulaire, principe
  de base de la technologie de CytoMétrie en Flux
  (CMF)
• Apparition successive des GB indivualisés dans un
  ensemble de mesure, permettant une analyse
  optique simultanée de plusieurs paramètres
  naturels (volume cellulaire, présence de
  granulation, hétérogénéité du noyau) ou modifiés
  (coloration, fluorescence) de la cellule.
• (CFM FACS  Fluorescence Activated Cell
  Sorter )

26
Hydrofocalisation
FOCALISATION HYDRODYNAMIQUE
-   Suspension cellulaire exposée à une
surpression (1 bar) injectée au centre d'une
veine liquide d'entraînement (liquide de gainage)
circulant à une vitesse différente -   Sortie de
la suspension cellulaire par un rétrécissement
d'un micro-orifice 50 µm à 300 µm -   Absence de
mélange "Suspension cellulaire/ liquide de
gainage" car densité du liquide de gainage gt
densité du liquide suspension cellulaire -   Ecoul
ement laminaire des cellules 500 à 5000
cellules/sec, 25 à 36 km/H, séparation 1mm,
orientation des cellules selon leur plus grand
axe dans le flux, et déformation cellulaire
uniforme en fonction de la cellule
27
La mesure optique
Diffraction lumineuse La cellule passe
individuellement devant un faisceau lumineux
conventionnel (lampe halogène à vapeur de Hg ou
de Xe) ou LASER (Argon, Kryton-Argon,
Helium-Neon)
28
Diffraction lumineuse Intensité de la lumière
diffractée peut être corrélée à des
caractéristiques morphologiques cellulaires -
Intensité de la lumière diffractée par la
cellule, recueillie dans l'axe de la lumière
incidente, dite "diffraction aux petits angles"
(2 à 6), (FALS Forward Angle Light Scatter, ou
FSC Forward Scatter Channel), est en relation
proportionnelle avec la taille cellulaire , la
forme cellulaire, et lindice de réfraction
cellulaire - Intensité de la lumière diffractée
par la cellule, recueillie de 8 à 90 de l'axe
de la lumière incidente, "diffraction aux grands
angles", (RALS Right Angle Light Scatter, ou SSC
Side Scatter Channel), est relation
proportionnelle avec l'hétérogénéité du contenu
cellulaire, présence/absence et taille de
granulation cytoplasmique, forme et taille du
noyau, rapport N/C, densité chromatinienne du
noyau, ce Paramètre est appelé  Granularité 
Détection aux petits angles Taille
Détection aux grands angles  Granularité 
29
Formule 5 Populations critères de
reconnaissance Les automates associent divers
principes technologiques permettant laccès à
divers critères de reconnaissance

• Variation Impédance ( Volume cellulaire)
• Principe Coulter pour le volume, ou mesure
  optique pour la taille
• Diffraction lumineuse ( taille cellulaire et
  Granularité)
• Diffraction de la lumière par la cellule
  (différents angles)
• Cytochimie sélective
• Coloration dun élément de la cellule, par simple
  affinité (excoloration des granulations
  éosinophiles) ou par activité enzymatique
  chromogène sélective (ex peroxydase des
  granulations)
• Conductivité (opacité) Courant Radio Haute
  Fréquence (RF)
• Structure de la cellule par un conduction courant
  haute fréquence
• Cytolyse
• Lyse sélective de populations. Ex tous les GB
  sauf PB. (évidemment dans tous les cas de FL
  complète automatisée, la lyse de GR est
  obligatoire

30
Détermination de la formule 5 populationsChaque
société sur ses automates combine plusieurs
technologies et donc plusieurs critères de
reconnaissance

• Impédance Conductivité HF Diffraction
  lumineuse
• BeckmanCoulter Automates MAXM, HmX, GenS, LH500,
  LH750
• Impédance Cytolyse Cytochimie (Actvité
  peroxydasique)
• BayerDiagnostics Automates Advia120, Technicon
  H2, H3
• Impédance Cytolyse Cytochimie (Coloration des
  granulationsEo.)
• HoribaAbx Automates Pentra60, Pentra80, Pentra120
• BayerDiagnostics Automates Advia70
• BeckmanCoulter Automates ACT 5Diff
• Diffraction lumineuse Cytochimie (Eosino)
  Cytolyse
• Sysmex SF3000, XE2100
• Diffraction lumineuse multi-angulaire sans
  cytolyse
• AbbottDiagnostics Automates CELL-DYN 3200, 3700,
  4000

31
Horiba ABX Impédance/Cytolyse/Cytochimie
Lampe tungstène
Absorption lumineuse
Matrice LMNE
Liquide de gainage
Volume
Saphir
Double Focalisation hydrodynamique
Traitement des cellules coloration des
granulations Eosinophiles (noir chlorazol)
32
Horiba ABX Impédance/Cytolyse/Cytochimie
MATRICE LMNE
33
Horiba ABX Impédance/Cytolyse/Cytochimie
Histogramme volumétrique Basophiles
Saphir

• Traitement des cellules
• Lyse de tous les blancs sauf des Basophiles

Mesure du Volume par variation dimpédance
34
Horiba ABX Impédance/Cytolyse/Cytochimie
Matrice LMNE
Nombre
Basophiles
Noyaux GB
Volume
Histogramme Basophiles
35
Horiba ABX Impédance/Cytolyse/Cytochimie
36
Exemple dhémogramme complet sur Pentra Horiba ABX
37
Beckman Coulter Impédance/ConductivitéHF/Diffracti
on
Mesures optiques
V o l u m e
Saphir Mesure dimpédance
Conductivité noyau
Mesure Volume
Diffraction Surface,granulations
Mesure Conductivité courant radio haute fréquence
Diffraction lumineuse Rotated Light Scatter angle
10 à 70 (Granularité)
38
Beckman Coulter Impédance/Conductivité/Diffraction
M
PE
M
GRA
L
PN
L
Diffraction
Conductivité
M
Soustraction des coordonnées  Diffraction  des
PN, PE, du nuage GRA, pour  révéler PB 
PB
L
39
Beckman CoulterImpédance/ConductivitéHF/Diffracti
on Analyse en 3D
40
Exemple dhémogramme complet sur Beckman Coulter
HmX
41
Abbott DiagnosticsDiffraction Laser
multi-angulaire
Laser ARGON
Granulations Eosinophiles
PMT1
90 ,Dépolarisée
90, Polarisée
PMT2
Conplexité du cytoplasme
Complexité du noyau
7
Numération Taille
0
42
Abbott Diagnostics Diffraction Laser
multi-angulaire Angles de diffraction et
critères de reconnaissance
90Pol/ 90dep Granulations
10 Structure
1/3 (0) Taille
Faisceau laser
Polarisation
1/3 (0) Taille
10 Structure
43
Abbott Diagnostics Diffraction Laser
multi-angulaire Diffractogrammes
90 Dépolarisé
Taille
NeEo
Mo
Eo
Ly
Ba
Ne
Débris
Structure
90 Polarisé
44
LA NUMERATION AUTOMATISEE DES RETICULOCYTES Exempl
e sur automate Pentra 120Rétic Horiba
ABX Marquage fluorescent des ARN
résiduels Fluorochrome Thiazole orange
Focalisation dans cellule de mesure, dune
dilution sanguine 1/3000 dans diluant isotonique
thiazole orange 2 informations
recueillies -comptage et volume par impédance
(saphir) -signal dintensité de fluorescence OFL
émise à 530 nm, déclenché par excitation
transitoire, recueillie à 90 du trajet optique
45
Matrice Réticulocytes Pentra 120 Horiba ABX
Réticulocytes à fluorescence élevée
OFL Intensité Fluorescence
Réticulocytes à fluorescence moyenne
Réticulocytes à fluorescence faible
Volume
GR matures
46
(No Transcript)
47
Bayer-Technicon Diffraction/Cytolyse/Cytochimie
Diffraction lumineuse enregistrée sous deux
angles différents
Matrice PEROX
Miroir semi-transparent
Petit angle 2/3 Taille
Lentille
Lampe tungstène-vapeur Halogène
Lentille
Grand angle 5/15Activité Peroxydasique
Miroir semi-transparent
Traitement des cellules substrat chromogène
révélateur de l'activité peroxydasique
Cellule photoélectrique
48
Bayer-Technicon Diffraction/Cytolyse/Cytochimie
Miroir semi-transparent
49
Bayer-Technicon Diffraction/Cytolyse/Cytochimie
Diagramme Perox et Diagramme Basophiles
Diagramme BASOS
Diagramme PEROX
Taille
Taille
Neutrophiles
.
LUC
.
.
.
.
.
.
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.
.
BASOS
.
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.
.
Mo
.
Ly
Noyaux monolobés
Noyaux Polylobés
Eosinophiles
Débris
Densité Chromatinienne /Segmentation
Activité peroxydase
50
SysmexVolume/RF/Cytolyse
Diagramme RF/Volume
Impulsion RF
Courant haute fréquence
Courant continu

Source fréquence radio
Impulsion impédance
Saphir
Sonde radio-fréquence
Condensateur

• Traitement des cellules
• Lyse différentielle et partielle des blancs.

51
Volume/RF/Cytolyses
Histogramme Eosino, et Histogramme Baso
Canal Eosinophiles
Canal Basophiles
Traitement des cellules Lyse différentielle.
Elle lyse tous les blancs sauf les Basophiles
Traitement des cellules Lyse différentielle.
Elle lyse tous les blancs sauf les Eosinophiles
52
Volume/RF/Cytolyses Matrice RF/Volume et
Histogrammes Eo et Ba
Nb
RF
Eo
Volume
Nb
Mo
Ba
Débris
Gr
Ly
Volume
Volume /DC
53
Le marquage dautres types cellulairesLes
RéticulocytesMarquage fluorescent sur ARNs
résiduels
Laser ARGON
Réticulocytes
PMT1
Filtre FL1 auto commutable
Abbot
PMT2
PMT3
Complexité.
7
Numération Taille
0
54
RéticulocytesFluorescence vs Complexité
55
Diffraction lumineuse Cytolyse

• Sysmex

56
SysmexDiffraction lumineuse/Cytolyse
Photo-diode Grand angle
Diode Laser
Photo-diode Petit angle
Cytomètre
Destruction des Ne et Eo Ly, Mo, et Ba intacts
Lyse des hématies Coloration des Eo.
57
Diffraction lumineuse/CytolyseEnregistrement de
deux angles de diffraction
Grands angles Densité intracellulaire (8-20)
Petits angles Taille (1-6)
Faisceau laser
Petits angles Taille
Grands angles Densité intracellulaire
58
Diffraction lumineuse/CytolyseFormule Ly, Mo,
Eo, NeBa
Mo
NeBa
Diffraction petits angles
Ly
Eo
Débris
Diffraction grands angles
59
Diffraction lumineuse/CytolyseDétermination de
la 5 ème pop les Neutrophiles
Ne 100 - Ly - Mo - Eo - Ba
Ba
Diffraction petits angles
Mo Ly
NeEo
Schizocytes
Diffraction grands angles
60
Diffraction lumineuse avec ou sans cytolyse
complémentaire

• Abbott

61
RéticulocytesNouveau bleu de méthylène
62
Cytolyse complémentaire

• Abbott (CD 3200)

63
Cytolyse le NOCCD 3200

• Comptage optique des noyaux nus
• Une action plus forte de la lyse provoque la
  destruction des membranes et la libération des
  noyaux.

64
Diffraction lumineuse Marquage

• Abbott

65
Marquage à l'iodure de propidium CD 4000
Laser ARGON
Granulations Eosinophiles
PMT1
90 Dépol.
Lobularité
90 Pol.
PMT2
PMT3
Complexité.
Viabilité Blcs Erythroblastes
7
Numération Taille
0
66
Analyse de la fluorescence Marquage des noyaux
accessibles
Lkc viables
Les noyaux nus des cellules lysées et les noyaux
des cellules mortes sont marqués par l'iodure de
propidium
Lkc non viables
Noyaux nus
67
LE MARQUAGE D'AUTRES TYPES CELLULAIRESRETICULOCY
TESCD4/CD8
68
Lymphocytes T4/T8Marquage des sites CD4/CD8 par
cytosphères (Ag-Ac)