Title: LES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE APPLIQUEES AUX HEPATITES VIRALES
1LES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE APPLIQUEES
AUX HEPATITES VIRALES
21 - Les techniques de quantification virale
Détection en point final
Détection en temps réel
3TMA Avantages et inconvénients
Avantages
- Amplification dADN ou dARN
- Permet lamplification simultanée de plusieurs
cibles
- Production damplicons ARN
- Réalisée dans un tube unique
- Jusquà 100 résultats obtenus en 4 heures
- Inconvénients
- Technique en grande partie manuelle
- sensibilité / contaminations
-
4bDNA
Versant HCV-RNA (bDNA3.0)
5bDNA
17 sondes de capture permettant une
quantification Équivalente de tous les génotypes
Versant HCV-RNA (bDNA3.0)
6bDNA
Caractéristiques Versant HCV RNA bDNA
5 Standards Gamme détalonnage externe Phage recombinant
Contrôles 1 Positif Fort 1 Positif faible 1 Négatif (simple)
Linéarité 3.200 40.106 copies/ml 615 7,7.106 UI/ml
Type Échantillon Plasma ou sérum
Volume échantillon 50 µl
Instrumentation Système 340 ou 440
7bDNA
Avantages
- Technique automatisée
- Excellente reproductibilité
- Permet la quantification de lARN VHC avec une
bonne linéarité - prise dessai faible 50 µl
- Inconvénients
- 84 résultats peuvent être rendus après 2
demi-journées sur 2 jours de manipulation - séries minimum de 24 échantillons
- Sensibilité relativement faible seuil de
détection à 615 UI/l
8PCR en point final
- Amplicor Roche ou LCx Abbott
- Détection colorimétrique ou fluorimétrique en
point final
9PCR en point final
Hépatite C
- Amplicor HCV 2.0 Roche
- Linéarité 600 à 500000 UI/ml
- Sensibilité 50 UI/ml en qualitatif, 600 en
Monitor
- Abbott LCx
- Linéarité jusquà 23 millions IU/ml
- Sensibilité 23 UI/ml
10(No Transcript)
11PCR en temps réel
12Gamme de linéarité
PCR en temps réel
13PCR en temps réel
Droite standard
14Principaux types de fluorophores
- SYBR Green
- TaqMan
- Sondes dhybridation
- MGB TaqMan
- Molecular beacon, Scorpions...
15Principe du FRET Fluorescence resonance Energy
Transfert
? dexcitation
Transfert dénergie sans transfert de photons
(non radiatif)
16Technologie TaqMan
quencher
reporter
17Technologie FRET par sondes spécifiques
18Cobas TaqMan 48
AbbottReal Time
Chargement des tubes primaires
Extraction automatisée cobas AmpliPrep
Extraction
1h30
Préparation de la réaction de PCR
15mn
CTM 48 et AL 3.1 station de pilotage
Amplification et Détection
3h
19Acides nucléiques totaux ARN et ADN Technologie
de capture sur billes de silice
Lyse, stabilisation et déprotéinisation
Capture
Fixation des Acides nucléiques sur la silice à la
surface des Magnetic Particle (Billes)
Casse des Virus et des cellules Libération des
acides nucléiques
Cible ADN
ou
Cible ARN (Virus)
Particle Magnetic (Billes) coatées à la silice
Virus ou Cellule
20Les avantages
- Une grande sensibilité
- Une gamme très étendue de linéarité
- Détection simultanée de plusieurs cibles
(standard interne de quantification) - Possibilité de Multiplex
Inconvénients
- Prise dessai importante denviron 1ml
- Appareillage spécifique
21Roche Cobas AmpliPrep/ TaqMan 48 HCV
Lhépatite C
Abbott Real Time HCV
CAP/CTM TaqMan HCV Linéarité 43 UI/ml à 69
millions UI/ml Sensibilité 15
UI/ml Spécificité 99,99 Génotype 1 à 6 ?
sous-estimation des génotypes 4
ART HCV Linéarité 12 UI/ml à 50 millions
UI/ml Sensibilité 12 UI/ml Spécificité
gt99 Génotype 1 à 6 pas de dépendance au
génotype
22Roche Cobas AmpliPrep/ TaqMan 48 HCV
Lhépatite B
Abbott Real Time HCV
- CAP/CTM TaqMan HBV
- Linéarité 54 - 110 millions UI/ml
- Sensibilité 12 UI/ml
- Spécificité 99,50
- Génotype A à G,
- mutants pré-core
ART HBV Linéarité 1.16 log c/ml à 9.16 log
c/ml Sensibilité 10 UI/ml Spécificité
100 Génotype A, B, C, D, E, F, G et H
détectés
232 - Les techniques de détection des génotypes
et des mutants
LIPA
SEQUENCAGE
Chromogène (NBT/BCIP)
Précipité Violet
24VERSANT HCV LiPA 2.0
25VERSANT HCV LiPA 2.0
26VERSANT HCV LiPA 2.0
- Extension du menu de génotypage
- GT 1à 6 c-l
- 5NCR GT 1-6
- Core GT 1a/1b et GT 6 c-l
- Amélioration du soustypage
- Meilleure Spécificité entre 1a et 1b
- Nouveau design des bandelettes
- Toujours 1 bandelette /1 résultat
- Marqué CE
- Une boite damplification comprenant tous les
réactifs nécessaires - Plusieurs méthodes dextraction testées et
validées
27TRUGENE HCV 5NC
28TRUGENE HCV 5NC
29Génotypage HCV
Avantages et inconvénients des deux techniques
- LIPA
- Possibilité de grandes séries avec détection
automatisable - Détection des doubles populations
- Lipa 1 sur amplicons Roche
- mais
- Lipa 1 mauvaise discrimination des sous-types
1, pas de 6 - Lipa 2 mise en œuvre nécessitant une
amplification spécifique
- TRUGENE
- pour épidémiologie (comparaison de souches)
- Meilleure discrimination des sous-types
- mais
- Petites séries uniquement
- Difficulté de mee de doubles populations
30Mutants HBV rappels
- Mutants précore
- Sur le gène précore mutation stop entraînant
larrêt de la synthèse de lAg Hbe - Sur le BCP (binding core promoter) qui agit sur
la régulation du gène core - Mutants YMDD
- Sur le gène de la polymérase, site daction des
analogues nucléosidiques (lamivudine)
31Mutants HBV rappels
Interêt de leur détection
- Mutants précore
- Lien avec lévolution de la maladie ?
- Lien avec la réponse au traitement ?
- Mutants de la polymérase
- Adaptation du ou des traitements
- Apparition quasi systématique en cas de tt
prolongé à la lamivudine seule - Certaines mutations pourraient compromettre les
traitements ultérieurs par dautres molécules - Arrêt du tt (sans risque) ou changement de
molécule
32TRUGENE HBV GENOTYPING
- Même technologie que pour lHCV
- Intérêt clinique différences de pronostic
dévolution spontanée et sous traitement des
génotypes - Occident A gt D (plus sensible à linterféron)
(Erhardt et al, Gut,2005, 54 1009-1013) - Asie B gtC (moins dactivité inflammatoire et
dévolution vers la cirrhose meilleure réponse
au tt)
33TRUGENETM HBV assay
500pb
237
101
SA Mutations 145R
preS1 preS2
HBsAg
RNase H
TP
SPACER
RT
F A B C D E
RT Mutations 173L 180M/V 204I/V
(YMDD) 207I 236T I169T, M250V T184S/A
and S202G
110
279
Lamivudine
Adefovir
Entecavir
- Carman et al. 1990 The Lancet, 336, 325-329
- Pillay et al. 1998 International Antiviral
News, 69 - Angus et al. 2003 Gastroenterology, 125,
292-297 - Colonno et al, 2005 EASL, Abstract 478
34TRUGENE HBV
Mutations Genotype (A to G)
TRUGENE HBV Report
35GeneLibrarian HBV Module Genotyping report
(1) Genotype
36GeneLibrarian HBV Module Genotyping report (2)
Mutation Profile
37DETECTION DES MUTANTS HBV
technique LIPA par Innogenetics
Mutants précore
Mutants YMDD
38Mutants et génotypes HBV
Comparaison des deux techniques
LIPA Manuel, facile à mettre en oeuvre, pas
dappareillage Non OUI OUI Non
TRUGENE HBV automatisé, facile à interpréter,
standardisé OUI OUI OUI OUI
Format Genotype viral (A-G) Mutations
RT Mutations Ag HBs Nouvelles Mutations sur
RT SA
39(No Transcript)
40Remerciements à
- Catherine Lemagne, société Bayer
- Nicolas Gautier, société Roche
- Christine Murigneux, société Abbott
- pour laide apportée dans liconographie