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INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO (CROSSLINKING)

Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de
Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
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INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO (CROSSLINKING)

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MODIFICACIÓN UNIPUNTUAL
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MODIFICACIÓN UNIPUNTUAL
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MODIFICACIÓN UNIPUNTUAL
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• Modificaciones unipuntuales de interés
• Objetivo hacer a la enzima insoluble en
  disoluciones acuosas.
• Uno de los métodos más tradicionales
• UNIÓN COVALENTE DE UN POLÍMERO ANFIPÁTICO.
• El más habitual monometoxipolietelienglicol
  (mPEG)

• Peso molecular variable. El mas usado sobre 5
  kDa.
• Dependiendo del grado de modificación, se
  consigue la total insolubilidad en agua.
• Este grado debe ser controlado cuidadosamente,
  pues puede conducir a la pérdida de actividad.
• La unión se suele hacer sobre lisinas.

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Uno de los más empleados. A través de TCT
(cloruro cianúrico) Debe controlarse bien
Copolímero con anh. succínico Enlace amida estable
A través de un carbamato Se sigue fácilmente la
activación.
Oxidación del mPEG Se activa el grupo ácido con
N-hidroxisuccinimda.
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• Otra característica interesante de esta
  metodología
• SE OBTIENEN DERIVADOS SOLUBLES EN CIERTOS
  DISOLVENTES ORGÁNICOS
• Benceno, tolueno y clorados (cloroformo,
  1,1,1-tricloroetano, tricloroetileno)

LA CATÁLISIS SE HACE HOMOGÉNEA.

• Inmovilización en disolventes orgánicos?
• Siempre que se pueda recuperar el derivado.
• Recuperación
• Añadiendo disolv. muy apolares (hexano, éter
  de petróleo) se produce la pptación.

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INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO (CROSSLINKING)

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REACTIVOS ENTRECRUZANTES DIFUNCIONALES
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Cross-Linked Enzyme Aggregates
Cross-Linked Enzymes
Crosslinked Spray-Dried Enzymes
Cross-Linked Enzyme Crystals
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Cross Linked Enzymes (CLE)
A comienzos de los años 60 se describe por
primera vez que el tratamiento de enzimas con
reactivos difuncionales (fundamentalmente
glutaraldehído) originaba derivados insolubles
con retención de actividad (CLEs) Al mismo
tiempo, se aumentaba la termoestabilidad (sobre
todo en enzimas multiméricas), pero se necesitan
unas condiciones muy delicadas (cantidad
crosslinker, T, pH, fuerza iónica). El material
obtenido era gelatinoso, y se intentó el
entrecruzamiento con otras moléculas para
aumentar propiedades mecánicas,
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ENTRECRUZAMIENTO INTRAMOLECULAR
Centro activo
Enzima nativa
Enzima desplegada (desnaturalizada)
Enzima estabilizada por un entrecruzamiento
intramolecular
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Cross Linked Enzyme Crystals (CLECs)
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Proceso de cristalización
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Entrecruzamientos más habituales
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Ventajas

1. Mayor actividad por unidad de volúmen (partículas
   uniformes, microporosas, formadas por sólo
   moléculas de enzima pura, lo que implica la
   máxima posible concentración de enzima)
2. Gran actividad específica
3. Fácil separación del medio de reacción, lo que
   facilita su reutilización.
4. Buenas propiedades mecánicas y termoestabilidad,
   así como resistencia a disolventes orgánicos.
5. No producen contaminación medioambiental.
6. No requieren soportes muy caros
7. Resistentes a la proteolisis

Desventajas

• Dificultad de cristalización
• Problemas de difusión (debe miminizarse el tamaño
  del cristal)
• Alto precio

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CLECS
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CLECS
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Cross Linked Enzyme Agreggates (CLEAs)
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POSIBILIDADES
Crosslinked Enzyme Crystals
Crosslinked Enzyme Aggregates
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ESQUEMA DE CLEAs
precipitante PEG Sales, disolventes
CLEAs
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ENTRECRUZAMIENTO INTERMOLECULAR
lento
rápido
Enzima multimérica
Enzima desnaturalizada (irreversible)
Enzima disociada (reversible)
Muy lento
Enzima multimérica entrecruzada
Enzima desnaturalizada entrecruzada (irreversible
)
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INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN

• Es el método más sencillo y antíguo (células de
  acetobacter adsorbidas sobre palos de madera para
  obtener vinagre por fermentación-1815)
• Se puede emplear tanto para células como para
  enzimas.
• Las fuerzas de unión son débiles
• Van der Waals
• Interacciones iónicas
• Enlaces de hidrógeno.
• Se producen fácilmente desorciones debido a
• variaciones concentración de sustrato.
• Cambios de pH
• cambios de T
• alteración de la fuerza iónica.

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INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN

• Soportes típicos
• carbón activo
• sílice, alúmina, titania, ...
• Tierra de diatomeas (Celite)
• celulosa
• resinas sintéticas
• CPG (controlled pore glasses).
• La mayoría de las enzimas se unen mejor a
  soportes polares
• Las lipasas se unen mejor a superficies
  hidrofóbicas
• MÉTODO MUY RECOMENDADO PARA ENZIMAS EN
  DISOLVENTES ORGÁNICOS (NO DESORCIÓN)

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INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN

• Unión iónica es bastante habitual.
• Se usan a nivel industrial resinas
  intercambiadoras
• catiónicas
• carboximetilcelulosa
• amberlite IRA
• aniónicas
• dietilaminoetilcelulosa (DEAE-celulosas)
• resinas Sephadex

• Se precisa un exquisito control del pH de la
  inmovilización Coherencia con la carga neta
  enzimática como consecuencia del pKa.

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INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN

• Metodologías empleadas
• métodos en batch
• ayuda de precipitación (ej acetona, isopropanol)
• métodos en columna
• plug flow
• lecho fluidizado
• REGLA DEL DIÁMETRO DE GIRO (spin diameter)

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