M

1
Métodos espectroscópicos en bioquímica

• Sensibilidad
• Especificidad
• Complementariedad
• Velocidad
• Accesibilidad
• Precio

2
Representación esquemática de las características
de las proteínas globulares que pueden seguirse
durante el plegamiento. Aunque no hay una sola
forma de seguir todos los detalles estructurales
de un intermediario del plegamiento el uso de
sondas múltiples y complementarias puede brindar
una imagen detallada de la distribución de
confromaciones que componen los transitorios del
plegamiento Current Opinion in Structural Biology
1996, 6630-636.
3
Citocromo c Estructura de rayos X
4

• Lisozima
• Estructura de RMN

5
Estructuras por RMN Átomos de la cadena para los
residuos 72-145 de las estructuras en disolución
de apo-BsCopAb (a) y Cu(I)-BsCopA(73-151) (b)
Representados como un tubo de radio variable
proporcional al valor del desvío estándar de la
posición de cada residuo. Se muestran también las
cadenas laterales del Cys85, Cys88 y el ion
Cu(I). J. Mol. Biol. (2002) 317, 415-429
6
Citocromo c Estructura de rayos X
7
(No Transcript)
8
Autoquenching
Cinética de plegamiento de citocromo c en
presencia y ausencia de imidazol por dilución de
desnaturalizante químico. Se mide la emisión
total de fluorescencia a l gt 320 nm
9
FRET
TIBS (2000) 25 631-637
10
Representación esquemática de las características
de las proteínas globulares que pueden seguirse
durante el plegamiento. Aunque no hay una sola
forma de seguir todos los detalles estructurales
de un intermediario del plegamiento el uso de
sondas múltiples y complementarias puede brindar
una imagen detallada de la distribución de
confromaciones que componen los transitorios del
plegamiento Current Opinion in Structural Biology
1996, 6630-636.
11
(No Transcript)
12
Representación esquemática de las características
de las proteínas globulares que pueden seguirse
durante el plegamiento. Aunque no hay una sola
forma de seguir todos los detalles estructurales
de un intermediario del plegamiento el uso de
sondas múltiples y complementarias puede brindar
una imagen detallada de la distribución de
confromaciones que componen los transitorios del
plegamiento Current Opinion in Structural Biology
1996, 6630-636.
13
Espectro Raman de elastina bovina (en sólido) en
la región de 500 a 1750 cm-1 y asignaciones
propuestas.
Descomposición de las bandas amida I de elastinas
bovinas a, BE b, BE-K. Perfiles experimentales
(línea continua) y calculados (línea punteada).
Asignaciones HW, agua de hidratación a, hélice
a b, hebra b U, conformaciones no identificadas
(giros ovillo).
J. BIOL. CHEM. (1995) 270 2609926103
14
a-T-4K
g-T-5K
J. BIOL. CHEM. (1998) 273 771777
15
Espectros FTIR en la región de 1700 a 1540 cm-1.
A, Proteína hp8 (no fosforilada, línea
continual), y PKAhp8 (fosforilada (línea
punteada). B, porcentajes calculados de
estructura secundaria en las muestras no
fosforiladas (barras blancas) y fosforiladas
(barras negras)
J. BIOL. CHEM. (2001) 276 27422751
16
Espectros de FTIR en el tiempo y análisis
cinético. (a) Espectros de absorción a tiempos de
1.1, 3.4, 5.7, 10.2, 21.6 y 103 ms. Espectro
antes de mezclar (negro) con trifluoroetanol y
espectro final (verde). (b) Segunda derivada de
los espectros de a (líneas continuas y los
resultados de un ajuste exponencial de tres
estados (punteado). (c) Los tres espectros
básicos resultantes del ajuste. (d) Curso
temporal de los tres estados deducidos del ajuste.
PNAS (2001) 98 66466649
17
Representación esquemática de las características
de las proteínas globulares que pueden seguirse
durante el plegamiento. Aunque no hay una sola
forma de seguir todos los detalles estructurales
de un intermediario del plegamiento el uso de
sondas múltiples y complementarias puede brindar
una imagen detallada de la distribución de
confromaciones que componen los transitorios del
plegamiento Current Opinion in Structural Biology
1996, 6630-636.
18
Despliegue de guanilato kinasa inducido por
cloruro de guanidinio medido por fluorescencia
con excitación a 282 nm
J. BIOL. CHEM. (1997) 272 1934319350
19
Intercambio de protones de amida para hp8 luego
de 5 minutos de incubación con D2O a 25 ºC.
J. BIOL. CHEM. (2001) 276 27422751
20
290 nm
21
Espectros de RMN 19F del despliegue de DHFR
marcada con 6-19F-triptofano al pasar de 0 a 5 M
urea con mezcla rápida a 22 ºC.
Intensidad de picos de resonancia asignados a W30
y W47 en la proteína desplegada. Hay una primera
fase demasiado rápida para registrar con este
método.
22
(No Transcript)
23
Representación esquemática de las características
de las proteínas globulares que pueden seguirse
durante el plegamiento. Aunque no hay una sola
forma de seguir todos los detalles estructurales
de un intermediario del plegamiento el uso de
sondas múltiples y complementarias puede brindar
una imagen detallada de la distribución de
confromaciones que componen los transitorios del
plegamiento Current Opinion in Structural Biology
1996, 6630-636.
24
Espectro visible de citocromo aa3 de P.
denitrificans oxidado (a) y reducido con
ditionito (b). La línea c es el espectro
diferencial de la forma reducida unida a CO menos
la forma reducida
J. BIOL. CHEM. (2002) 277 1356313568
25
Espectros de resonancia raman de citocromo aa3 de
P. Denitrificans reducido (a) mutante Y280H (b).
Los espectros c y d corresponden al complejo con
12CO y 13CO respectivamente. El espectro
diferencial 12CO 13CO aparecen en e.
J. BIOL. CHEM. (2002) 277 1356313568
26

1. Cobalamina(II) en solución
2. Complejo enzima Cobalamina(II)
3. Complejo enzima Cobalamina (II)
   5-desoxiadenosina

Biochem. J. (2001) 355, 131-137
27
Representación esquemática de las características
de las proteínas globulares que pueden seguirse
durante el plegamiento. Aunque no hay una sola
forma de seguir todos los detalles estructurales
de un intermediario del plegamiento el uso de
sondas múltiples y complementarias puede brindar
una imagen detallada de la distribución de
confromaciones que componen los transitorios del
plegamiento Current Opinion in Structural Biology
1996, 6630-636.
28
Tiempos de correlación
Espectro de EPR del aducto MNP/Hb a partir de la
reacción de Hb con peroxinitrito y comparación
con los aductos MNP/péptido (A) Hb ONOO-
MNP (C) Igual que A 0.5 mg/mL de pronasa. (E)
Péptido GGYR (10 mM) ONOO- MNP.
Biochemistry (1999) 38 2078-2087
29
(No Transcript)