Northern blotting

1
Northern blotting
2
reverse Northern blotting
3
cDNA arrays (continued)

• macro-arrays
• low-density
• filter-supported
• radioactive probes (duplicates)
• low sensitivity
• only cDNA clones spotted
• cheap

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cDNA arrays (continued)

• micro-arrays
• high-density
• glass-supported
• fluorescent probes (single slide)
• high sensitivity
• ability to spot oligonucleotides
• very expensive

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I microarrays
Tessuto della prostata, normale
Tessuto della prostata, tumorale
Un microarray è un supporto solido sul quale sono
stati posizionati diverse migliaia di cDNA in
spot separati. Ciascuno spot rappresenta un gene,
in quanto contiene numerose copie di un cDNA
corrispondente a tale gene.
In questo esempio i cDNA sono stati posizionati
su di un vetrino, simile ai normali vetrini usati
per listologia.
6
Microarray technology
Probes
Microarray synthetized by photolithography or
EST/oligo linking
http//www.ym.edu.tw/excellence/HBP/HBP_CP4/proced
ure.htm
7
utilizzo dei microarrays
Tessuto della prostata, normale
Tessuto della prostata, tumorale
si confrontano i profili di espressione genica di
due campioni differenti. E necessario estrarre
le molecole di mRNA dai due campioni.
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Arrays
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Targets
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Hybridisation
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Data Processing
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(No Transcript)
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Spot-finding (1)
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Confronto dei profili di espressione genica in
due campioni cellulari diversi
Estrazione dellmRNA dai 2 campioni di cellule
che si vogliono confrontare
(1)
(2)
Conversione in cDNA
(6)
Immagine a colori raffigurante il microarray
Marcatura con 2 fluorocromi diversi
(3)
Eccitazione della fluorescenza tramite laser
(4)
(5)
Riconoscimento tra i cDNA
provenienti dai 2 campioni e quelli già presenti
sul microarray
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STUDIO DEI PROMOTORI siti di legame dei
fattori di trascrizione EMSA
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Trans Factor Methods EMSA
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Trans Factor Methods EMSA
Electromobility Shift
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Trans Factor Methods Consensus Sequence Capture
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Il saggio EMSA identifica interazioni tra DNA e
proteine
20
Il saggio EMSA identifica interazioni tra DNA e
proteine

• Competizione con stesso sito, sito analogo, sito
  mutato
• Identificazione dei fattori coinvolti tramite
  supershift con anticorpi

Lodish Figure 10-7
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Il footprint con DNasi I permette di localizzare
il sito di interazione tra proteina e DNA
Lodish Figure 10-6