Cytochrom P450, Polymorphismus, Transporter

1
Cytochrom P450, Polymorphismus, Transporter
2
Cytochrom P450, Polymorphismus, Transporter
Vom Dünndarm (small intesitine) aus gelangen
aufgenom-mene Xenobiotica über die Pfort Ader
(portal vein) in die Leber. Hier finden eine
ganze Reihe von biochemischen Modifikationen
statt.
3
Cytochrom P450 Metabolismus (I)
Zuerst First pass effectVorwiedend lipophile
oder schwere (MW gt500) Verbindungen werden
ekzessiv metabolisiert Diese werden dadurch
hydrophiler und damit leichter ausscheidbar
gemacht.
Verantwortlich für die als Phase I bezeichneten
Reaktionen sind hauptsächlich eine Gruppe von
Cytochrom P450 Enzymen (CYP).
4
Cytochrom P450 Metabolismus (II)
Die Monooxygenierung der Substrate erfolgt in
einem katalytischen Zyklus an einem
Hämoglobin-Eisen (Fe)
5
Cytochrom P450 Metabolismus (III)
Die am Metabolismus beteiligten Cytochrome sind
überwiegend Monooxygenasen, die evolutionär von
der Steroid- und Fettsäuren-biosynthese stammen
Im Menschen wurden bisher 17 CYP-Familien mit
ungefähr 50 Isoformen charakterisiert
Nomenklatur CYP 3 A 4
15 A-B
Familiegt40 Sequenz-homolgie
Isoenzym
Allel
Unterfamiliegt55 Sequenz-homolgie
6
Cytochrom P450 Gene families
Human 14
Molluscs 1
CYP450
Plants 22
Insects 3
Bacteria 18
Yeasts 2
Nematodes 3
Fungi 11
7
Human cytochrome P450 family
Aus der Superfamilie der Cytochrome kommen
folgende Familien im Menschen vor CYP 1-5, 7, 8,
11, 17, 19, 21, 24, 26, 27, 39, 46, 51 CYP 1,
2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 3 Metabolismus von
Xenobiotica CYP 2G1, 7, 8B1, 11, 17, 19, 21,
27A1, 46, 51 Steroid
Metabolismus CYP 2J2, 4, 5, 8A1 Fettsäuren
Metabolismus CYP 24 (Vitamin D), 26 (retinoic
acid), 27B1 (Vitamin D), ...
8
Cytochrom P450 Enzyme (I)
Flavin Monooxygenase Isoenzyme Alkohol
Dehydrogenase Aldehyd Oxidase Monoamin
Dehydrogenase (MAO)
Die Redoxaktivität wird durch ein Eisenporphyrin
im aktiven Zentrum ermöglicht
9
Cytochrom P450 Enzyme (II)
Trotz der niedrigen Sequenzidentität von CYP aus
unterschiedlichen Organismen,ist die
Tertiärstruktur hochkonserviert.
Überlagerung vonhCYP 2C9 (1OG5.pdb) undCYP 450
BM3 (2BMH.pdb) Bacillus megaterium
Gegenüber den bakteriellen CYP besitzen die
microsomalen mammalian CYP eine zusätzliche
Transmembranhelix als Membrananker
10
Cytochrom P450 Enzyme (III)
Die überwiegende Menge an CYP befindet sich in
der Leber, aber auch in der Dünndarmwand kommen
bestimmte vor.
Die mammalian CYP sind an das endoplasmatische
Reticulum gebunden, also membranständig.
11
Cytochrom P450 Enzyme (IV)
Am Metabolismus von endogenden Stoffen sind vor
allem CYP 3A4, CYP 2D6, und CYP 2C9 beteiligt.
12
Substratspezifität der CYP (I)
Spezifische Substrate der einzelnen human CYP CYP
1A2 verapamil, imipramine, amitryptiline, caffei
ne (arylamine N-oxidation)
CYP 2A6 nicotine
CYP 2B6 cyclophosphamid
CYP 2C9 diclofenac, naproxen, piroxicam, warfarin
CYP 2C19 diazepam, omeprazole, propanolol
CYP 2D6 amitryptiline, captopril, codeine,
mianserin, chlorpromazine
CYP 2E1 dapsone, ethanol, halothane, paracetamol
CYP 3A4 alprazolam, cisapride, terfenadine, ...
siehe http//medicine.iupui.edu/flockhart/
13
Substratspezifität der CYP (II)
Decision tree for human P450 substrates
CYP 1A2, CYP 2A-E, CYP 3A4
high
low
CYP 3A4
CYP 2E1
Volume
medium
acidic
basic
pKa
CYP 2D6
CYP 2C9
neutral
CYP 1A2, CYP 2A, 2B
low
high
planarity
CYP 2B6
CYP 1A2
medium
CYP 2A6
Lit D.F.V. Lewis Biochem. Pharmacol. 60 (2000)
293
14
Cytochrom P450 Metabolismus (IV)
Im Rahmen der präklinischen Entwicklung ist auch
die Erfassung der Metabolite von Wirkstoffen
notwendig, da diese u.U. toxisch sein
können. Dazu exprimiert man die entsprechenden
CYP Enzymedurch Klonierung in E. coli, und
verfolgt die Umsetzung der Wirkstoffe mittels
Gaschromatographie und Massenspektroskopie. Dies
ermöglicht die selektive Bestimmung von
Metaboliten durch einzelne Cytochrom P450 Enzyme,
bzw. deren genetische Varianten. Diese Ergebnisse
werden dann mit den analogen in vivo Ergebnissen
aus Tiermodellen verglichen.
Lit. zum KlonierenR.Knippers, Molekulare
Genetik 8.Auflage, Kapitel 10
15
Cytochrom P450 Polymorphismus
Jeder Mensch ist (mehr oder minder) anderst
Der Phänotyp läßt sich anhand der tatsächlichen
Aktivität oder der Menge des exprimierten Enzyms
unterscheiden.
Der Genotyp widerum ist durch die individuelle
DNA Sequenz bestimmt.
D.h. der gleiche Genotyp läßt verschiedene
Phänotypen zu(Diploider Satz an Chromosomen,
differentielle Expression)
Entsprechend der metabolischen Aktivität
unterscheidet man bei CYP normale (extensive
metabolizer), schwache (poor metabolizer), und
verstärkte (ultra-rapid metabolizer) Umsetzer.
Lit K. Nagata et al. Drug Metabol. Pharmacokin
3 (2002) 167
16
Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
SNPs sind Unterschiede einer einzelnen Base in
der DNA die innerhalb einer Population
auftauchen. Als Polymorphismus bezeichnet man
Allele die bei mindestens 1 der Population
auftreten. D.h. diese Genotypen sind regulär. Im
Gegensatz dazu bezeichnet man Veränderungen des
Genoms die seltener als 1 auftauchen nur als
Mutationen.
Typischerweise werden bei seltenen, ererbten
Krankheiten Mutationen im kodierenden Bereich von
DNA-Abschnitten festgestellt.
Lit A.D. Rose Nature 405 (2000) 857.
17
CYP 2D6 Polymorphismus (I)
Am besten untersucht ist der Polymorphismus von
CYP 2D6(Debrisoquine 4-hydroxylase)
Zuerst für die Umsetzung von debrisoquine und
sparteine (Antipsychotica) beschrieben
Siehe D.B.Goldstein et al. Nature Rev. Genetics
4 (2003) 937.
Lokalisiert auf Chromosom 22Von den 75 Allelen
exprimieren 26 Proteine siehe http//www.imm.ki.se
/CYPalleles/cyp2d6.htm
18
CYP 2D6 Polymorphismus (II)
Lit J. van der Weide et al. Ann. Clin. Biochem
36 (1999) 722
19
CYP 2D6 Polymorphismus (III)
MGLEALVPLAVIVAIFLLLVDLMHRRQRWAARYPPGPLPLPGLGNLLHVD
FQNTPYCFDQ LRRRFGDVFSLQLAWTPVVVLNGLAAVREALVTHGEDT
ADRPPVPITQILGFGPRSQGVF LARYGPAWREQRRFSVSTLRNLGLGK
KSLEQWVTEEAACLCAAFANHSGRPFRPNGLLDK AVSNVIASLTCGRR
FEYDDPRFLRLLDLAQEGLKEESGFLREVLNAVPVLLHIPALAGKV LRF
QKAFLTQLDELLTEHRMTWDPAQPPRDLTEAFLAEMEKAKGNPESSFNDE
NLRIVVA DLFSAGMVTTSTTLAWGLLLMILHPDVQRRVQQEIDDVIGQ
VRRPEMGDQAHMPYTTAVI HEVQRFGDIVPLGMTHMTSRDIEVQGFRI
PKGTTLITNLSSVLKDEAVWEKPFRFHPEHF LDAQGHFVKPEAFLPFSA
GRRACLGEPLARMELFLFFTSLLQHFSFSVPTGQPRPSHHGV FAFLVSP
SPYELCAVPR
poor debrisoquine metabolism S
R impaired mechanism of sparteine
poor debrisoquine metabolism I
poor debrisoquine metabolism R
missing in CYP2D69 allele
P loss of activity in CYP2D67
T impaired metabolism of sparteine in alleles 2,
10, 12, 14 and 17 of CYP2D6
siehe http//www.expasy.org/cgi-bin/niceprot.pl?P1
0635
20
CYP 2D6 Polymorphismus (III)
Variabilität der Debrisoquine-4-Hydroxylierung
number of individuals (european population)
homocygote extensive metabolizers
homocygote poor metabolizers
metabolic rate
heterocygote extensive metabolizers
Lit T. Winkler Deutsche Apothekerzeitung 140
(2000) 38
21
CYP 2D6 Polymorphismus (IV)
Der poor metabolizer Phänotyp hat Auswirkungen
auf den Metabolismus von mehr als 25 aller
gängigen Medikamente, da er zu einer erhöhten
Konzentration nicht umgesetzer Xenobiotika führt.

Lit H.K.Kroemer M.Eichelbaum. Life Sci. 56
(1995) 2285.
Deshalb wurde CYP2D6 Genotypisierung bereits zur
Auswahl geeigneter Testpersonen für die Phase III
in klinischen Studien eingesetzt Lamotrigine,
Desipramine (Antidepressiva)
Lit M.P.Murphy et al. Pharmacogenetics 10 (2000)
583.
22
Polymorphismus weiterer CYPs
CYP 1A2 individuell hohe, mittlere und langsame
Umsetzung von caffeine CYP 2B6 fehlt in 3-4 der
kaukasischen Bevölkerung CYP 2C9 Defizit bei 1-3
der kaukasischen Bev. CYP 2C19 Individuen mit
inaktivem Enzym (3-6 der kaukasischen und 15-20
der asiatischen Bevölkerung) CYP 2D6 schwache
Metabolisierer bei 5-8 der europäischen, 10
der kaukasischen und lt1 der japanischen
Bevölkerung. Überexpression (doppeltes Gen) bei
Teilen der afrikanischen und orientalischen Bev.
CYP 3A4 nur geringe Mutationen im Zusammenhang
mit dem Polymorphismus des MDR1 Transporter Gen
23
Genotypisierung von CYP P450 Allelen
Die Firma Affymetrix (USA) hat unter Verwendung
von immobilisierten synthetischen Kopien von P450
Nukleotiden Microarrays (Gen Chips) entwickelt,
die die Indentifizierung aller klinisch
relevanten Allele erlauben.
24
Induktion und Regelung von CYP3A (I)
Man hat eine ganze Reihe von Xenobiotica gefunden
die zur verstärkter Exprimierung von Enzymen der
CYP3A Familie führen.indinavir Antiviralefavir
enz Antiviralcyclosporin Immunosuppressantcar
bamazepine Anticonvulsantatorvastatin HMG CoA
Reductase Inhibitor tamoxifen Antineoplastic,
Anti-hormone
Diese binden an den pregnane X receptor (PXR)der
als Transkriptionsfaktor die expression von des
CYP3A Genes reguliert.
Lit T.M. Wilson et al. Nature Rev. Drug Disc. 1
(2002) 259
25
Induktion und Regelung von CYP3A (II)
Der PXR Rezeptor wirkt als Heterodimer zusammen
mit dem retinoid X receptor (RXR)
Als Folge der Induktion von CYP3A kommt es zu
verstärktem Metabolismus der aufgenommenen
Substanz.Im ungünstigsten Fall kommt es dadurch
zu Nebenwirkungen, wie etwa Leberentzündung.
26
RXR und weitere nukleare Rezeptoren (I)
Als spezifischen, endogenen Aktivator von RXR hat
man 5b-pregnane-3,20-dione gefunden. Im
Gegensatz dazu ist PXR sehr viel weniger
spezifisch und wird sowohl von Glucocorticoiden
als auch von Anti-Glucocorticoiden aktiviert.
Der unspezifische constitutive androgen receptor
(CAR) findet sich dagegen im Cytoplasma und
dimerisiert erst im Nucleus mit RXR. Analog zu
PXR wird hier das CYP2B Gen reguliert.
Ebenfalls hohe Sequenzhomologie wurde für den
vitamin D receptor (VDR) der CYP27 reguliert, und
für den arylhydrocarbon receptor (AHR) (Dioxin
Rezeptor) gefunden.
27
RXR und weitere nukleare Rezeptoren (II)
Diese nuklearen Rezeptoren gehören zu einer
Familie von Transkriptionsfaktoren. Jeder besitzt
eine doppelte Zink-Finger DNA-Bindungsdomäne
(DBD), sowie eine größere Carboxy-terminale
Ligandenbindungsdomäne (LBD).
Da ihre Liganden erst später gefunden wurden,
werden sie als orphan nuclear receptors
bezeichnet.
28
Human Orphan Nuclear Receptors
Receptor (Gene ID) Natural ligand (synthetic
ligand) CAR (NR1I3) 3a,5a-AndrostanolCOUP
(NR2F1) ERR (NR3B1) (4-Hydroxytamoxifen)FXR
(NR1H4) Chenodeoxycholic acidHNF4
(NR2A1) Palmitic acidLRH (NR5A2) PPAR
(NR1C1) Eicosapentaenoic acidPXR
(NR1I2) 5b-Pregnane-3,20-dione, (Rifampicin)ROR
(NR1F1) Stearic acidRXR (NR2B1) 9-cis-RNA
Auswahl, mehr in der angebenen Literatur
Lit T.M.Wilson J.T. Moore Mol. Endocrin. 16
(2002) 1135.
29
Induktion und Regelung von CYP3A (III)
Hyperforin, der natürliche Bestandteil des St.
Johns wort (Johanniskraut, Hypericum
performatum) zeigt die bisher höchste gemessene
Affinität zu PXR (Kd 27 nM)
Anwendung Heilmittel gegen Gallestauung
(cholestasis) sowie als mildes Antidepressivuum
30
Induktion und Regelung von CYP3A (IV)
Struktur von PXR mit Hyperforin (1M13.pdb)
Lit R.E. Watkins et al. Biochemistry 42 (2003)
1430
31
Induktion weiterer CYP
CYP 1A2 omeprazole, insulin, aromatic
hydrocarbons (cigarette smoking, charbroiled
meat)
Führt zu erhöhter Coffein-Konzentration im Plasma
wenn man aufhört zu Rauchen
CYP 2C9 rifampicin, secobarbital
CYP 2C19 carbamazepine, prednisone
CYP 2D6 dexamethason
CYP 2E1 ethanol, isoniazid
CYP 3A4 glucocorticoide, phenobarbitone,
rifampicin, nevirapine, sulfadimindine,
nevirapine, sulfinpyrazone, troglitazone
32
Typische Inhibitoren von CYP (I)
CYP 1A2 cimetidine, ciprofloxacine,
enoxacine... grapefruit juice (naringin,
6,7-dihydroxy- bergamottin)
CYP 2C9 chloramphenicol, amiodarone,
omeprazole,...
CYP 2C19 fluoxetine, fluvastatin, sertraline,...
CYP 2D6 fluoxetine, paroxetine, quinidine,
haloperidol, ritonavir,...
CYP 2E1 disulfiram, cimetidine,...
CYP 3A4 cannabinoids, erythromycin, ritonavir,
ketokonazole, grapefruit juice
siehe http//medicine.iupui.edu/flockhart/
33
Transporter (I)
Im Gegensatz zur passiven Diffusion durch
Membranen, bewirken Transporter verstärkten
influx in, oder efflux aus Kompartimenten, wobei
ATP verbraucht wird.
Lit A.Ayrton et al. Xenobiotica 31 (2001) 469
34
Transporter (II)
Membranständige Transporter die an der
Pharmakokinetik von endogenden Stoffen beteiligt
sind
Superfamilien solute carriers (SLC) ATP-binding
cassette (ABC) P-type ATPase
Lit M.K.Leabman et al. Proc.Nat.Acad.Sci.USA 100
(2003) 5896
35
Struktur von Membrantransportern
Membrantransporter sind Proteine mit teilweise
über 12 Transmembranhelices die über Loops
verbunden sind. Bisher gelang die
Strukturaufklärung mittelsX-ray noch bei keinem
Transporter.
Lit M.K.Leabman et al. Proc.Nat.Acad.Sci.USA 100
(2003) 5896
36
P-glycoprotein
P-gp gehört zur Familie der multidrug resistant
proteins (MDR) und wird von dem MDR1 Gen
kodiert.Insbesondere die Bioverfügbarkeit von
Psychopharmaka wird limitiert durch den
Rücktransport aus dem Gehirn in den
Blutkreislauf. Transport von Stoffen aus der
Leber in den gastrointestinalen Trakt (bilary
excretion) z.B. vonIndinavir Die Überexpression
von P-gp führt bei Krebszellen zu Resistenz gegen
Antineoplastica.
Lit A.Ayrton et al. Xenobiotica 31 (2001)
469.A.Seelig Eur.J.Biochem. 251 (1998) 252.
37
Transportproteine für Organische Ionen
Dazu gehören die Familien der Organic Anion
Transporter (OAT) und der Organic Cation
Transporter (OCT) Diese sind vor allem an der
Ausscheidung hydrophiler Katabolite beteiligt
Lit A.Ayrton et al. Xenobiotica 31 (2001) 469
38
Transportproteine für influx
Es gibt aber auch Transporter für die aktive
Aufnahme von Stoffen aus dem Dünndarm Pept1
(intestinal peptide transporter)
Transmembranprotein mit 12 TM-HelicesVerantwortl
ich für Stickstoffaufnahme ! Substrate kleine
Peptide (Di- und Tripeptide, sowie Verbindungen
mit Peptidcharakter, z.B. Captopril)
39
Polymorphismus bei Transportern
Auch Transporter weisen erhebliche genetische
Variationen aufGen Protein / Funktion ABCB1
(ATP-binding cassette subfamily B member 1) P-gp
efflux SLC6A3 (Dopamine Transporter)
Neurotransmitter SLC6A4 (Serotonin Transporter)
Neurotransmitter ADRB2 (b-adrenergic receptor)
Rezeptor für Betablocker ALOX5 (Arachidonate
5-lipoxygenase) Biosynthese von
Leukotrienen
Siehe D.B.Goldstein et al. Nature Rev. Genetics
4 (2003) 937.