D

1
DÉROULEMENT DE LA PRODUCTION DES HYBRIDOMES
SELECTION DES HYBRIDOMES
TEST DES HYBRIDOMES
FUSION DES CELLULES
PRODUCTION DES HYBRIDOMES
ISOLEMENT DES HYBRIDOMES
OBTENTION DES CELLULES
2
OBTENTION DES CELLULES
IMMUNISATION DE LA SOURIS AVEC LANTIGÈNE ÉTUDIÉ
OBTENTION DES LYMPHOCYTES SPECIFIQUES
UTILISATION DE CELLULES MYELOMATEUSES HGPRT-
OBTENTION DES CELLULES IMMORTELLES
3
FUSION DES CELLULES
FUSION DES MEMBRANES CELLULAIRES AVEC DU PEG
(poly éthylène glycol)
FUSION DES MEMBRANES CELLULAIRES PAR
ELECTROPORATION
4
SELECTIONDESHYBRIDOMES
Culture sur milieu HAT Hypoxanthine Aminoptérine
Thymidine
MORT CELLULAIRE Impossibilité de se diviser
MORT CELLULAIRE disparition aprés quelques
divisions
HYBRIDOME SELECTIONNE
5
ISOLEMENTDESHYBRIDOMES
Dès que la croissance est suffisante, il faut
propager les cultures d'hybridomes productrices
de l'anticorps désiré (transferts des puits de
0,3 à 2 ml, puis à des bouteilles de 25 ml), les
conserver et les cloner. Deux méthodes sont
utilisées pour obtenir un clone à partir d'une
cellule
Une colonie une cellule initiale
Une ou zéro cellules par puit
6
TESTDESHYBRIDOMES

• TEST SUR LE SURNAGEANT DE CHAQUE PUIT
• DE LA PRESENCE DES ANTICORPS MONOCLONAUX
• PAR LA METHODE ELISA
• DU TYPE DANTICORPS PRODUIT
• PAR DES METHODES DIMMUNOPRECIPITATION

7
ELISA
TEST SUR LE SURNAGEANT DE CHAQUE PUIT DE LA
PRESENCE DES ANTICORPS MONOCLONAUX PAR LA METHODE
ELISA
8
PRODUCTIONDESACM
Production par cultures cellulaires
Amplification des hybridomes
OBTENTION DES ANTICORPS MONOCLONAUX
Production dans les liquides d'ascites
CONSERVATION DES HYBRIDOMES
9
AMP
HGPRT
Hypoxanthine
IMP
GMP
Azasérine
Aminoptérine
Synthése endogène
Aminoptérine
TMP
Thymidine
Thymidine Kinase
Milieu HAT Hypoxanthine, aminoptérine, thymidine
Milieu Haza Hypoxanthine, azasérine
10
L'obtention d'anticorps purs en quantité
suffisante (milligrammes) permet - de
caractériser les antigénes étudiés et de mettre
au point des dosages radioimmunologiques - le
couplage d'anticorps monoclonaux sur Sepharose. -
le couplage des anticorps monoclonaux sur
plastique. Des séparations et purifications
cellulaires (méthode dite de paning ) ont
ainsi éte réalisées, comme par exemple la
séparation des lymphocytes B et T humains ou
celle de certaines populations cellulaires
dérivant de la moelle. La production
d'anticorps contre des antigénes de
différenciation cellulaire ou contre des
antigènes présents sur de faibles fractions de
populations cellulaires. C'est par exemple le cas
des marqueurs de sous-populations de lymphocytes
T ou de cellules nerveuses.
11
LES CELLULES DE MYELOME

• Les cellules de myélome, les plus couramment
  utilisées, sont celles de la souche de souris
  Balb/c.
• Cultiver les cellules murines dans un milieu MEM
  Dulbecco contenant 10-20 de sérum de veau et
  4,5 g/l de glucose.
• Incuber les cellules à 37C dans une atmosphère
  enrichie en C02 (5-10 ), avec une inoculation de
  5.10 4 cellules/ml.
• Maintenir les cellules en culture à des densités
  de 5.10 4 à 1.10 6 cellules/ml.
• Pour la fusion, les cellules de myélome doivent
  être en phase logarithmique et le taux de
  cellules vivantes doit être supérieur à 98 .
• Sur des lignées mises en culture depuis au moins
  une semaine, déterminer le taux de survie par un
  test de viabilité au bleu trypan.
• Contrôler la mutation HGRT par addition de 20
  µg/m d'azaguanine.

12
LES LYMPHOCYTES IMMUNISATION DE LANIMAL

• Habituellement, on utilise la même lignée
  d'animaux que celle employée pour l'obtention des
  cellules myélomes. La souche de souris Balb/c est
  donc appropriée, d'autant plus qu'elle se révèle
  excellente pour la production ultérieure in vivo
  des hybridomes.
• Mélanger l'antigène choisi en émulsion avec un
  adjuvant qui stimule le système immunitaire.
  L'adjuvant de Freund peut par exemple être
  utilisé il s'agit d'une suspension de
  mycobactéries inactivées.
• Linjecter sous la peau ou dans la cavité
  péritonéale de l'animal. La plus grande attention
  doit être apportée, afin que l'expérimentateur ne
  s'injecte pas l adjuvant, ce qui provoquerait
  des complications immunitaires longues
  (arthrite).
• Répéter plusieurs fois ce processus à un
  intervalle de 3-4 semaines ainsi les
  lymphocytes B qui réagissent à l'antigène choisi
  sont chaque fois plus fortement stimulés. La
  dernière injection se fait par voie
  intraveineuse. Cette introduction dans le sang
  d'une forte dose d'antigène induit une
  prolifération intense des cellules stimulées,
  après environ 3 jours.

13
ISOLEMENT DES LYMPHOCYTES

• Après 3 jours tuer l'animal et extraire sa rate
  sous condition stérile.
• Broyer ensuite cet organe et mettre les cellules
  en suspension dans un milieu dépourvu de sérum.
• Ces cellules sont transférées dans un tube à
  centrifugation contenant 3 ml de lymphoprep. Les
  lymphocytes sont séparés des globules rouges et
  du liquide de la rate par centrifugation sur
  gradient de densité.
• Centrifuger à 400 g pendant 30 minutes.
  Récupérer les lymphocytes à l'interface et les
  laver avec du PBS (centrifugation 10 minutes à
  100 g).
• Reprendre le culot cellulaire avec 2 ml de PBS.
  Homogénéiser doucement avec une pipette. Quand
  la suspension est homogène réaliser un test de
  viabilité au bleu Trypan suivi d'un comptage à
  l'hématimètre
• On obtient 1.107 à 1.10 8 cellules par rate de
  souris. Le taux de survie est déterminé par
  coloration au bleu trypan ou par fluorescence.

14
FUSION AVEC PEG

• Ces lymphocytes servent directement à la fusion
  avec les cellules myélomes, en phase
  exponentielle.
• Laver les cellules du myélome dans un tampon car
  la fusion s'opère difficilement en présence de
  protéines sériques
• Préparer les suspensions cellulaires pour avoir
  une proportion de 5 à 1. Les mélanger.
• Rajouter 1 ml de PEG concentré à 50 dans 40 ml
  de mélange cellulaire. Le traitement de fusion ne
  doit pas durer longtemps (au maximum quelques
  minutes), car le PEG est cytotoxique. Quant le
  PEG est ajouté aux cellules et délicatement
  mélangé, des agrégats cellulaires se forment, ce
  qui indique que les membranes cellulaires sont en
  voie de fusion.
• Eliminer le PEG par centrifugation et laver les
  cellules. Ces dernières sont diluées avec des
  milieux de culture et distribuées à raison de 1
  ml dans chaque puits de plaques de
  microtitration.

15
ELECTROFUSION

• La fusion des cellules, à l'aide d'un champ
  électrique, nécessite un appareillage assez
  coûteux, mais offre l'avantage d'une augmentation
  à la fois des taux de fusion (110 au lieu de 1
  104) et du nombre de cellules hybrides stables.
  Une majorité des hybrides provient de la fusion
  de deux cellules et non de plusieurs, comme c'est
  le cas avec le PEG. Le processus de fusion peut
  être observé au microscope. Ce procédé se réalise
  en deux étapes.
• Mettre les cellules à fusionner en suspension
  dans un milieu à faible conductibilité. Celui ci
  est obtenu par mise dans un champ électrique
  alternatif d'une amplitude de 250 V/cm et à une
  fréquence de 1,5 MHz. Les cellules, en migrant
  dans ce champ électrique, forment des chaînettes
  de plusieurs cellules en établissant le contact
  membranaire entre les cellules à fusionner.
• Faire subir un choc électrique de forte
  intensité (3.5 KV/cm) pendant trois fois 15 µs.
  On provoque ainsi des perforations réversibles
  des membranes cellulaires dans les zones de
  contact ce qui entraîne la fusion des cellules.

16
SÉLECTION DES HYBRIDOMES

• Les cellules obtenues après traitement fusogène
  sont mises en suspension dans un milieu de
  croissance et cultivées dans des puits. Le
  premier travail va être de sélectionner les
  seules cellules hybrides.
• Après 24 heures, ajouter une solution de HAT
  (hypoxanthine, aminoptérine, thymidine) dans le
  milieu de croissance. Dans ce milieu sélectif,
  seuls les hybrides lymphocytes (HGPRT) /
  cellules myélomes (HGPRT-) survivent, grâce à
  l'hypoxanthine et à la thymidine fournies par le
  milieu HAT.
• Après deux semaines, éliminer progressivement le
  milieu HAT. On considère que les seules cellules
  encore capables de se multiplier ont stabilisé
  leur résistance au HAT et sont obligatoirement
  des hybrides. On permet alors aux hybrides
  d'utiliser de nouveau la voie endogène de
  synthèse des nucléotides.

17
SÉLECTION DES HYBRIDOMES PRODUCTEURS

• Le second travail de sélection consistera à
  détecter les hybrides sécrétant des anticorps à
  spécificité définie. Ces tests doivent être
  sensibles (environ 10-8 g d'anticorps/ml),
  reproductibles et réalisables rapidement en grand
  nombre. Il faut éviter la saturation des puits de
  culture ou leur envahissement par des hybrides
  non sécréteurs.
• Mettre l'antigène en solution dans un tampon et
  le distribuer dans des plaques de microtitration
  en chlorure de polyvinyle. Les protéines adhérent
  de façon non spécifique au chlorure de polyvinyle
  (PVC). Si une molécule porteuse a été utilisée
  pour l'immunisation, il faut en utiliser une
  différente pour coupler le peptide et changer
  d'agent couplant.
• Bloquer les autres sites libres à la surface du
  plastique par addition d'albumine ou d'autres
  protéines ajoutées en concentration saturante.
• Ajouter dans ces puits un aliquot des
  surnageants des cultures d'hybridomes contenant
  les anticorps. Incuber environ 60 minutes pour
  permettre à l'anticorps de se fixer à l'antigène
  immobilisé. Laver les puits avec un tampon.

18
SÉLECTION DES HYBRIDOMES PRODUCTEURS

• De nombreux procédés sont maintenant utilisables
  test radioimmunologique (RIA), révélations
  immunoenzymatiques (ELISA), immunofluorescence,
  cytotoxicité, immunocytologie, etc. ....
• Ajouter le réactif révélateur. Ce réactif est
  soit un anticorps antimurin (produit par une
  espèce différente de l espèce souris) soit la
  protéine A bactérienne qui a une excellente
  affinité pour de nombreuses immunoglobulines. Ces
  molécules sont marquées par un radioisotope, un
  fluorochrome ou une enzyme.
• Suivant le type de révélateur effectuer la
  lecture des puits à l œil nu ou avec un appareil
  de mesure ( compteur à scintillation ou
  spectrofluorimètre).
• Le couplage se fait le plus souvent avec de
  l'iode marquée (I126), avec un composé
  chimiluminescent (dérivés du luminol) ou avec une
  enzyme telle que la peroxydase, la phosphatase
  alcaline ou la b-galactosidase. Cette dernière
  méthode est dénommée ELISA (enzyme-linked-immunoab
  sorbent-assay).

19
CLONAGE EN MILIEU GÉLOSÉ
Le clonage des cellules s effectue en milieu
semi-solide préparé avec une gélose se
solidifiant à 32C. Les colonies formées sont
transférées en milieu liquide dans des puits. Le
milieu se présente sous forme de deux couches de
bacto-agar de 0.5 et 0.3 autoclavé et coulé
dans des boites de culture de 5 cm de diamétre.
Lagar aura été préparé avec du milieu HAT. ?
Couler la première couche dagar à 0.5 dans la
boite de culture en diluant une solution stock à
5 avec le milieu HAT ( 5 ml par boite). ?
Préparer des aliquots de 5 ml dagar à 0.3 et
les laisser en surfusion à 44 C. Juste avant de
couler la couche supérieure, rajouter 10 µl des
hybridomes à 3.105 cellules/ml. Préparer trois
boites de chaque dilution. ? Transférer les
boites dans l incubateur à CO2 (5) en
s assurant que latmosphère est suffisamment
humide. Laisser 10 à 14 jours dans
l incubateur. ? Au bout de 14 jours, transférer
les colonies apparues dans des plaques de
microtitration et les tester pour l activité
anticorps.
20
CLONAGE PAR DILUTION LIMITE
A une dilution suffisante, on estime que les
cultures proviennent d'une seule cellule. Pour
plus de sécurité, le procédé de clonage par
dilution est répété. A une moyenne de 0,5 cellule
par puits, on estime que 30 des puits ne
contiennent qu'une seule cellule. Cette méthode
est une procédure en trois temps. ? La première
série de dilutions permet de sélectionner les
cellules qui sécrètent de haut niveaux
d anticorps. Effectuer des séries de dilutions
pour obtenir 5.102 cellules/ml et mettre en
culture en milieu liquide HAT dans des puits de
0,3 ml. Laisser en incubateur 7 jours ? La
deuxième série de dilutions permet de
sélectionner les lignées cellulaires à partir
dune seule cellule. Elle nécessite la présence
supplémentaire d une couche de cellules de rate.
Effectuer des séries de dilutions pour obtenir 1
cellule pour un puits ou deux puits. Mettre en
culture en milieu liquide HAT. Laisser en
incubateur 10-14 jours en changeant le milieu
régulièrement. ? La troisième série de dilutions
permet de vérifier le clonage.
21
CONSERVATION

• Aux divers stades de la sélection, les hybridomes
  choisis sont congelés. On pallie ainsi à toute
  contamination ou accident ultérieur et on a en
  phase finale du matériel d'inoculation pour la
  production.
• centrifuger un volume de suspension cellulaire
  contenant 107 cellules.
• Enlever le surnageant et mélanger avec le milieu
  de congélation préparé préalablement (0.9 ml de
  SVF et 0.1 ml de DMSO placé dans la glace)
• Transvaser dans un tube à congélation renseigné.
• Le placer à -20 C pendant environ 30 minutes.
• Le transférer alors à -80C pendant 1 journée.
• Le transférer et le conserver sous azote liquide.

22
PRODUCTION DES ANTICORPS PAR REALISATION D ASCITE

• Pour la production in vivo, une ascite
  (épanchement péritonéal) est créée.
• Réaliser deux injections de 0,5 ml de pristane à
  une semaine d'intervalle chez une souris de
  lignée définie dont le fonctionnement du système
  immunitaire a été inhibé par une injection de
  tétraméthylpentadécane .
• Une semaine plus tard, injecter dans la cavité
  péritonéale de la souris environ 107 hybridomes
  dans un milieu sans sérum.
• Après une à deux semaines, recueillir par
  ponction de la cavité péritonéale 2 à 5 ml de
  liquide contenant 2 à 10 mg/ml d'anticorps, soit
  au maximum 50 mg par animal.
• La culture en ascite permet une production
  flexible de petites quantités d'anticorps
  monoclonaux (au maximum de l'ordre du gramme).
  Cette production in vivo présente cependant
  plusieurs inconvénients notamment la petite
  taille de la souris, la présence de nombreuses
  enzymes protéolytiques dans l'ascite. De plus le
  liquide de l ascite contient un mélange de
  protéines dont certaines sont des
  immunoglobulines. I1 se pose aussi le problème
  éthique de l'utilisation des animaux et de
  l'injection de cellules cancéreuses. La
  production in vivo devient de plus en plus une
  technique obsolète.

23
PRODUCTION EN BIOREACTEUR
Pour diverses applications, il est nécessaire de
produire des quantités plus importantes
d anticorps. Pour l'imagerie in vivo, on doit
disposer de quelques centaines de microgrammes
d'anticorps par patient, soit plusieurs grammes
pour 10 000 patients. Pour la thérapie in vivo
plusieurs centaines de milligrammes sont requises
par patient, soit plusieurs kilogrammes pour le
traitement de 10 000 patients. Les premières
cultures s'effectuent dans des récipients à fond
plat, les deuxièmes se font dans des bouteilles
cylindriques mises à incuber sur un agitateur à
rotation lente et régulière. La production a plus
grande échelle peut s'effectuer soit en
suspensions homogènes (réacteurs à agitation
mécanique ou réacteurs "air lift" à agitation par
circulation d'air), soit avec des cellules
immobilisées (fibres creuses, microcapsules,
cartouches de céramique). La capacité des
bioréacteurs actuellement utilisés se situe entre
10 et 10 000 litres. Les quantités d'anticorps
produits sont fonction du type de cellule, du
milieu et des conditions environnementales. La
productivité se situe habituellement pour les
anticorps murins entre 30 et 300 µg/ml.
24
PRODUCTION EN BIOREACTEUR
Les résultats en système "air lift" sont
meilleurs que ceux observés dans les flacons
agités (multiplication par un facteur de 2,5).
Dans certains cas une augmentation considérable
de la productivité spécifique (2 à 5 fois) est
obtenue par des cultures réalisées avec des
cellules en perfusion qui sont maintenues en
phase stationnaire. Un cycle de production dure
typiquement 6 à 16 jours. Pour une telle
production, il est recommandé dutiliser des
milieux définis et non des milieux à base de
sérum contenant un mélange complexe de protéines.
On réduit ainsi les coûts de production et de
purification. De plus, cela permet d'éliminer le
risque de contaminations accidentelles par des
virus ou des micro-organismes éventuellement
présents dans le sérum. L'optimisation et la
régulation de la production sont plus facile avec
un milieu de composition définie (par exemple le
milieu eRDF). Ces milieux contiennent encore
souvent des hormones et des facteurs de
croissances (prolactine, corticotropine,
insuline, transferrine, testostérone et acide
linoléique).
25
EXTRACTION ET PURIFICATION DES ANTICORPS PRODUITS
La première étape consiste à éliminer les
cellules. Cela est réalisé facilement à grande
échelle par centrifugation continue.
L'ultrafiltration à flux tangentiel permet
ensuite d'obtenir un concentré contenant
habituellement 1 à 5 g d'anticorps par litre. Les
techniques de purification dépendent des
caractéristiques de l'anticorps et de l'usage que
l'on peut en faire. Ces méthodes sont
principalement les suivantes -
précipitation dans une solution de sulfate
d'ammonium généralement à 50 -
chromatographie par échange d'ions (DEAE par
exemple) - chromatographie par filtration
sur gel - chromatographie par affinité avec
la protéine A du staphylocoque ou avec des
anticorps anti-immunoglobulines fixés à de la
sépharose activée. Les anticorps sont ensuite
élués par des gradients de pH ou de force
ionique. I1 est nécessaire d'utiliser des
techniques peu agressives car les anticorps sont
fragiles et facilement dénaturés. Pour des
anticorps à utiliser in vivo, un degré de pureté
élevé est requis. L'obstacle majeur tient non pas
aux techniques de purification mais à la
sensibilité des méthodes de dosage des impuretés.