Introducci

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Introducción a la espectroscopía vibracional

• .Conceptos básicos
• Estados vibracionales y energía
• Modos normales de vibración
• frecuencia de vibraciones
• .Técnicas
• Espectroscopía infrarroja
• Regiones del IR
• Grupos funcionales
• "Huellas digitales"
• Número de ondas e intensidad
• Reglas de selección
• FTIR y sus ventajas

• Espectroscopía Raman
• Dispersión inelástica de fotones (Stokes y
  anti-Stokes)
• Reglas de selección
• Ventajas sobre el IR
• Resonanacia Raman
• .Aplicaciones a proteínas
• Análisis de estructura secundaria
• Cálculos
• Asignaciones
• Uso de isótopos
• Grupos laterales

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• Bibliografía
• Campbell, I.D. and Dwek, R.A. Biological
  Spectroscopy Benjamin Cummings (1984)
• Cantor, C.R. and Schimmel, P.R. Biophysical
  Chemistry Vol 2, (1984).
• Krimm, S and Jagdeesh Bandekar, Vibrational
  Spectroscopy and Conformation of Peptides,
  Polypeptides and Proteins Adv. Prot Chem. 38
  (1986), p. 180
• Susi, H and Byler, D.M. Resolution Enhanced
  Fourier Transform Infrared Spectroscopy of
  Enzymes Methods in Enzymology 130, p 290
• Williams, R.W. Protein Secondary Structure
  Analysis Using Raman Amide I and Amide III
  Spectra Methods in Enzymology 130, p 311

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Introducción a la espectroscopía vibracional
Espectro electromagnético
Frecuencia (Hz) Longitud de onda Tipo de radiación Tipos de transición
1020 - 1024 10-12 - 10-16 m Rayos gamma Nuclear
1017 - 1020 1 nm - 1 pm Rayos X Electrones internos
1015 - 1017 400 - 1 nm Ultravioleta Electrones externos
4.3x1014 - 7.5x1014 700 - 400 nm Visible Electrones externos
1012-1014 2.5 µm - 700 nm Infrarrojo Vibraciones
108 - 1012 1 mm - 2.5 µm Microondas Rotaciones
100 - 108 108 - 1 m Radiofrecuencia Inversión de spin
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Estados vibracionales y energía
Frecuencia de la vibración k constante de
fuerza del enlace F -kx µ masa reducida,
para un sistema diatómico
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Modos normales de vibración (3N - 5)
cm-1 IR RAMAN
estiramiento (sim) 1340 -
estiramiento (asim) 2349 -
deformación 667 -
deformación 667 -
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Técnicas INFRARROJO
Reglas de selección No todas las vibraciones
serán activas en IR Sólo aquellas en las que
cambie el momento dipolar permanente durante la
vibración
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INFRARROJO
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INFRARROJO
N-H
C-H
CO
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FTIREspectrometría IR con Transformada de
Fourier

1. Mejor relación señal/ruido ya que la luz no debe
   pasar por un monocromador.
2. Se miden todas las frecuencias a la vez lo que da
   mucha mayor rapidez
3. Puede tener una resolución de menos de 0.01 cm-1
4. Los espectros pasan necesariamente por una
   computadora lo que facilita el análisis y manejo
   espectral

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Modos normales de vibración del grupo amida
(valores para metilacetamida)
amida II (1567 F)
amida III (1299 M)
estiramiento NH (3236 F)
amida I (1653 F)
amida VI (600 M)
amida VII (206 M)
amida IV (627 D)
amida V (725 F)
estiramiento NC (1096 D)
estiramiento CN y CC (881 D)
deformación CCN (436 D)
deformación CNC (289 D)
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(No Transcript)
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Estructura secundaria
ovillo estadístico
hélice a
transición a ? b
b antiparalela
Susi, H., Timasheff, S and Stevens, L. J Biol
Chem (1967) 242, 5460-5466
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Estructura secundaria
Estructura a
Estructura b
Goormaghtigh, E Ruysschaert, J. M. and Raussens,
V Biophysical Journal Volume 90 April 2006
29462957
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Porcentajes de hélice y cadena extendida
obtenidas por rayos X y FTIR
Proteína Hélice Hélice Cadena extendida Cadena extendida
Proteína FTIR RX FTIR RX
Carboxipeptidasa 40 39 33 30
a-Quimotripsina 12 10 50 49
Concanavalina A 4 2 60 60
Lisozima 41 45 21 19
Papaína 27 29 32 29
Ribonucleasa A 21 22 50 46
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(No Transcript)
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Uso de isótopos
1H2O
2H2O
Efecto de la deuteración de la proteína sobre la
posición de la banda amida I J. Biol. Chem.
(1998) 273 771-777
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Uso de isótopos


BIAP (A) apo BIAP (B) Asignación tentativa
1682 nCO amida I (hoja b)
1660 nCO amida I (giro)
16511652 1652 nCO amida I (hélice a)
1633 1633 nCO amida I (hoja b)
15861577 15861571 nCO COO Asp o Glu
1547 1547 d N-H amida II
15161517 15161517 n OH anillo Tyr
1443 1455 d N-2H amida II y 2HOH
Asignación tentativa de las diferentes bandas en
el espectro FTIR de BIAP y apoBIAP en 2H2O, pH 6.6
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Uso de isótopos
1 27 min 2 63 min 3 180 min 4 21 h
Efecto del tiempo en la deuteración de tripsina
en 2H2O a 25º C, pD 3.1 Eur. J. Biochem. 48,
339-344 (1974)
19
Isótopos y posición de las bandas
FTIR de monóxido de carbono unido a citocromo c
aa3 de T. termophilus.
Referencia Pinakoulaki, E. Soulimane, T. and
Varotsis, C. (2002) J. Biol. Chem. 27732867.
20
Unión de ligandos
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Técnicas Raman Dispersión inelástica de fotones
Sir Chandrasekhara Venkata Raman, (??????????
???????????) Tiruchirapalli, Tamil Nadu
-7/11/1888  Bangalore, Karnataka - 21/11/1970
Premio Nobel de Física 1930
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muestra
Láser, luz monocromática
Regla de selección Para que la vibración sea
activa en Raman debe provocar un cambio en la
polarizabilidad de la molécula.
Monocromador, espectrógrafo

• Ventajas de Raman con respecto a IR
• Se mide en el visible o el UV donde los
  detectores son mucho más sensibles
• El agua produce una dispersión Raman muy débil
• La resonancia Raman permite sondear grupos
  asociados a cromóforos con una sensibilidad 102-
  104 veces mayor

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N
N
24
(No Transcript)
25
(No Transcript)
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Resonancia Raman
estado electrónico excitado
estado energético virtual
Resonancia Raman
Raman
estado electrónico basal
La resonancia Raman es más intensa que la
dispersión Raman, pero necesita que exista un
cromóforo y sólo se intensifican las bandas
debidas al cromóforo
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l 406.7 nm
Das, T. K., S. Mazumdar and S. Mitra (1998). Eur
J Biochem 254(3) 662-70
28
hemo 0.34 mM SO42- 400 mM
SO42-
Spiro, T. C. and Strekas, T. G. (1973) JACS 96
338
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Uso de isótopos
Unión de óxido nítrico a superóxido reductasa de
Pyrococcus furiosus
l 476 nm
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Espectro IR de BSA sólida (azul) y espectro Raman
de BSA en solución en amortiguador de fosfato
(rojo).
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Infrarrojo y Raman

• El fenómeno de absorción es más intenso por lo
  que se requieren muestras menores
• El equipamiento es más sencillo y de uso más
  flexible
• No presenta interferencias con otros fenómenos
  físicos (p. ej. fluorescencia)

• Se mide en el visible o UV donde los detectores
  son mucho más sensibles
• El agua produce una dispersión Raman muy débil
• El Raman resonante permite sondear grupos
  asociados a cromóforos con una sensibilidad
  varios órdenes de magnitud mayor

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Introducción a la espectroscopía vibracional

• .Conceptos básicos
• Estados vibracionales y energía
• Modos normales de vibración
• frecuencia de vibraciones
• .Técnicas
• Espectroscopía infrarroja
• Regiones del IR
• Grupos funcionales
• "Huellas digitales"
• Número de ondas e intensidad
• Reglas de selección
• FTIR y sus ventajas

• Espectroscopía Raman
• Dispersión inelástica de fotones (Stokes y
  anti-Stokes)
• Reglas de selección
• Ventajas sobre el IR
• Resonanacia Raman
• .Aplicaciones a proteínas
• Análisis de estructura secundaria
• Cálculos
• Asignaciones
• Uso de isótopos
• Grupos laterales