G

1
Génkifejezodés regulációja
2
Neuron limfocita (ellenanyag termelés)
Vörös vértestek (haemoglobin termelés) Hasnyálmir
igy B sejtek insulin
A sejtek glukagon
ezekben a sejtekben ugyanazok a gének
találhatóak, a különbségek pedig a
génexpresszióra vezethetok vissza.
differenciáció
3
A multicelluláris organizmusok sejtjei azonos
DNS-t (genomot) tartalmaznak
birka, szarvasmarha, disznó, kecske, egér
4
Különféle sejtek eltéro expressziós mintázatot
mutatnak.
each type of tumor has a characteristic gene
expression pattern
DNA microarray
Differences in mRNA expression patterns among
different types of human cancer cells. The mRNA
levels of 1800 selected genes (arranged top to
bottom) were determined for 142 different human
tumors (arranged left to right), each from a
different patient. Each small red bar indicates
that the given gene in the given tumor is
transcribed at a level significantly higher than
the average across all the cell lines. Each
small green bar indicates a less-than-average
expression level, and each black bar denotes an
expression level that is close to average across
the different tumors.
5
Különféle sejtek eltéro expressziós mintázatot
mutatnak.
Fehérjék szintjén 2-D fehérje gél-elfo.
the proteins have been separated by molecular
weight (top to bottom) and isoelectric point,
the pH at which the protein has no net charge
(right to left). The protein spots artificially
colored red are common to both samples those in
blue are specific to one of the two tissues.
The differences between the two tissue samples
vastly outweigh their similarities even for
proteins that are shared between the two tissues,
their relative abundance is usually different.
Note that this technique separates proteins both
by size and charge therefore a protein that
has, for example, several different
phosphorylation states will appear as a series
of horizontal spots (see upper right-hand portion
of right panel).
6
A sejtek képesek megváltoztatni expressziós
mintázatukat külso ingerek hatására.
7
Az expresszió több szinten is regulálható.
8
Transzkripció regulációja
1960-as évek a géneket ki/be lehet kapcsolni
paradigma, E. coli kísérletek
Eukarióták kromatin szerkezet
promoter
5
3
r
r
r
ORF
IS
RNS-pol
9
Transzkripció regulációja
promoter
5
3
r
ORF
r
r
IS
RNS-pol
A gén - szabályzó fehérjék hozzákapcsolódnak a
regulátor DNS szekvenicákhoz

• különféle g-r fehérjék különféle
  DNS-szekvenciákat ismernek fel
• g-r fehérjék a DNS nagy árkában helyezkednek el
• g-r fehérjék molekuláris kölcsönhatásokat
  (hidrogén-, ionos-kötések,
• hidrofób interakciók) létesítenek nukleotidák
  bázisaival
• habár az egyedi molekuláris kölcsönhatások
  gyengék, általában
• 20 DNS fehérje közti interakció stabilizálja
  és specifikussá teszi a kölcsönhatást
• ezek a kölcsönhatások nem eredményezik a
  komplementer DNS-szálak
• közti H-hídak felbomlását

10
DNS-köto doménjeik révén a gén - szabályó
fehérjék hozzákapcsolódnak a regulátor DNS
szekvenicákhoz
11
Aktivátorok és represszorok
Baktériumok - genom 4,6 x106 bp / 4300 gén
- génexpresszió
és tápanyag források
Triptofán operon
triptofán represszor
The clustered genes in E. coli that code for
enzymes that manufacture the amino acid
tryptophan. These five genes are transcribed as
a single mRNA molecule, a feature that allows
their expression to be controlled coordinately.
12
Triptofán operon
triptofán represszor
The binding of tryptophan to the tryptophan
repressor protein changes the conformation of the
repressor. The conformational change enables
this gene regulatory protein to bind tightly to a
specific DNA sequence (the operator), thereby
blocking transcription of the genes encoding the
enzymes required to produce tryptophan (the trp
operon). The three-dimensional structure of this
bacterial helix-turn-helix protein, as determined
by x-ray diffraction with and without tryptophan
bound, is illustrated. Tryptophan binding
increases the distance between the two
recognition helices in the homodimer, allowing
the repressor to fit snugly on the operator.
(Adapted from R. Zhang et al., Nature
327591597, 1987.)
13
Aktivátorok
promoter-közeli régiókhoz kötodnek és segítik az
RNS-polimeráz II megkötését, majd a hatékony
transzkripciót
CAP
CAP
cAMP
CAP
cAMP
A magas cAMP koncentráció jelzi a baktériumnak,
hogy a glükóz koncentrációja alacsony a sejtben,
és ennek következtében olyan gének lesznek
bekapcsolva, amelyek más cukor molekulák
degradációjában muködnek közre.
14
A lac-operon muködését a lac represszor és a CAP
aktivátor szabályozza
A lac-operon azokat az enzimeket kódolja, amelyek
a laktóz diszaharid importjáért és elbontásáért
felelosek.
Glükóz mint preferált C-forrás
15
The mechanisms by which gene regulatory proteins
control gene transcription in procaryotes.
(A) Negative regulation (B) positive
regulation. Note that the addition of an
inducing ligand can turn on a gene either by
removing a gene repressor protein from the DNA
(upper left panel) or by causing a gene activator
protein to bind (lower right panel). Likewise,
the addition of an inhibitory ligand can turn
off a gene either by removing a gene activator
protein from the DNA (upper right panel) or by
causing a gene repressor protein to bind (lower
left panel).
16
Az eukarióta transzkripció szabályozása összetett.
4 alapveto különbség van a prokariota és
eukariota transzkripciós reguláció között
Prokariotákban egy RNS-polimeráz van, míg az
eukariotákban három, RNS-polimeráz I rRNS
gének RNS-polimeráz II fehérje-kódoló gének és
kis RNS gének (spliceosome-ban lévok)
RNS-polimeráz III t-RNS gének, 5S rRNS gének,
kis RNS gének
A bakteriális RNS-polimeráz önmagában képes a
transzkripció iniciációjára, azonban az
eukarioták esetében az RNS-polimerázoknak
szükségük van un. általános transzkripciós
faktorokra.
A baktériumokban az aktivátor és represszor
molekulák kizárólag a promoter-közeli elemekhez
kötodnek. Az eukariotákban a promoter-közeli
elemeken kívül számos és igencsak távoli
szabályzó szekvencia létezik, amelyekhez ezek
hozzá kötodhetnek, végtelen számú regulációs
mechanizmust eredményeznek.
Az eukariota transzkripció iniciációja során ki
kell csomagolni a kromatin szerkezetet
17
Az eukarioták RNS-polimeráz II. általános
transzkripciós faktorai
TATA-box majdnem minden eukariota promoterben
megtalálható.
DNS lokális disztorziója
Transzkripciós iniciációs komplex összeszerelése
RNS-polimeráz II megkezdi a transzkripciót,
néhány transzkriptet processzáló fehérjét
magával visz.
Transzkripciós iniciációs komplex disszociációja
18
Az eukariota transzkripció cisz szabályzása
Az RNS polimeráz II a maximális transzkripció
sebesség eléréséhez három cisz elemet, promotert,
promoter-közeli és enhanszer - silencer elemeket
igényli.
GC-box
CCAAT-box
Promoter
Promoter- közeli elemek
regulátor DNS szekvenciák (10 bp -10 kb
szakasz több száz féle)
19
A transzkripció transz szabályozása

• Transz-ható transzkripciós faktorok (TAF-ok). Sok
  ismert.
• Enhanszerekhez vagy a promoterhez kötodnek,
  segítik az RNS polimeráz II kezdo-komplex
  kialakulását.
• Az éleszto TAF-ok két tagja, a GCN4 és a GAL4
  nevezetes. A GCN4 aminosav bioszintetikus utak
  génjeit aktiválja. Aminosav éhezéskor a GCN4
  mennyisége megno, ami fokozza a szabályzott gének
  transzkripcióját.
• GAL4 a galaktóz metabolizmus TAF-ja. Két
  doménbol, DNS köto és aktiváló doménbol áll. Jól
  ismert, 17 nukleotid hosszú UAS-hez kötodik.

20
Az eukariota transzkripció iniciálásában távoli
genomikus régiók (enhanszer és silencer) is
szerepet játszanak aktivátor és represszor
fehérjék révén.
Enhancerek/silencerek up- és/vagy downstream is
elhelyezkedhetnek.
Kromatin kihurkolás révén az enhancer/silencerek
gén-reguláló fehérjéi közvetlenül a promoter
régióra fejtik ki hatásukat.
Az enhancer/silencerek gén-reguláló fehérjéi
kromatin fehérjék révén befolyásolhatják a
kromatin szerkezetét, azaz a promoter regió
hozzáférhetoségét az RNS-polimeráz II és az
általános transzkripciós faktorok esetébén.
21
A promoter regió kromatin szerkezete befolyásolja
a transzkripció iniciációját
A nukleoszómák gátolják a transzkripciót, ha a
promoter-régió közvetlenül felettük
helyezkedik el.
22
A transzkripció szabályzó apparátusa.
23
Molekuláris mechanizmusok és sejtsorsok
kombinációs kontroll
Sejtmemória a differenciáció során a
génexpressziós mintázat szigorúan szabályzott.
kombinációs kontroll
tranziens génexpresszió szabályozása ideiglenes
jellegu
24
day-to-day regulation of cell function
Ugyanaz az aktivátor vagy represszor több gén
transzkripcióját is szabályozhatja
kombinációs kontroll
A glükokortikoid receptor mint több
gén transzkripciós szabályzó fehérjéje
25
kombinációs kontroll
és sejtdifferenciáció
Myo D
aktin, myozin, ion csatorna, receptor gének
Myoblasztok fúziója
izomsejt
Fibroblasztok
Myo D
26
kombinációs kontroll
és sejtdifferenciáció
Különféle gén-reguláló fehérjék kombinációja
többféle sejt típust eredményez
27
Egy adott sejt génexpressziós mintázata
átörökítheto az útodsejtekre.
a positive feedback loop can create cell memory
A fo transzkripciós regulátor fehérje saját
génexpresszióját is szabályozza.
Az expressziós mintázat atörökítése a kromatin
szerkezete révén (X kromoszóma inaktivació)
28
A szervképzodést egyetlen gén-reguláló fehérje
kiválthatja.
Ey mint gén-reguláló fehérje számos más gén
expresszióját szabályozza, amelyek a szem
kialakulásáért felelosek.
29
A transzkripcós apparátuson kívül néhány tényezo
jelentos hatással lehet a transzkripció
eredményességére. 1. A kódoló DNS szakasz
metilálása (5-metilcitozin) megakadályozza a
transzkripciót. 2. Az mRNS stabilitása
befolyásolja a géntermék mennyiségét. Például a
poliA farok stabilizálja a mRNS-t. Rövid
féléletideju mRNS-ek 3 végén jellegzetes
sorrendek ismerhetok fel, pl. A(U)nA ismétlodések
jelentosen csökkentik a fél-élettartamot.
30
(No Transcript)
31
Transzkripciós szabályozás testtáj koordináták
és testszelvényezettség kialakulása
The story of eve (even-skipped).
32
Examples of the phenotypes of mutations
affecting the three types of segmentation genes.
In each case the areas shaded in green on the
normal larva (left) are deleted in the mutant or
are replaced by mirror-image duplicates of the
unaffected regions.
33
Anterior posterior polaritás
A petesejt citoplazmája nem homogén!
The nonuniform distribution of four gene
regulatory proteins in an early Drosophila
embryo. At this stage the embryo is a syncytium,
with multiple nuclei in a common cytoplasm.
Although not illustrated in these drawings, all
of these proteins are concentrated in the nuclei.
34
7 reguláló modul a promoter-közeli régióban
Minden modul eltéro DNS szekvenciával rendelkezik
és a négy GAP-fehérje koncentráció-gradíensének
megfelelo kombinációja aktiválja egyedileg az
eve gént a paraszegmentekben.
Experiment demonstrating the modular
construction of the eve gene regulatory region.
(A) A 480-nucleotide-pair piece of the eve
regulatory region was removed and inserted
upstream of a test promoter that directs the
synthesis of the enzyme ß-galactosidase. (B) When
this artificial construct was reintroduced into
the genome of Drosophila embryos, the embryos
expressed ß-galactosidase (detectable by
histochemical staining) precisely in the
position of the second of the seven Eve stripes
(C) The seven Eve stripes.
35
The nuclei are exposed directly to positional
cues in the form of concentrations of gene
regulatory proteins
Distribution of the gene regulatory proteins responsible for ensuring that eve is expressed in stripe 2. The distributions of these proteins were visualized by staining a developing Drosophila embryo with antibodies directed against each of the four proteins The expression of eve in stripe 2 occurs only at the position where the two activators (Bicoid and Hunchback) are present and the two repressors (Giant and Krüppel) are absent. In fly embryos that lack Krüppel, for example, stripe 2 expands posteriorly. The eve gene itself encodes a gene regulatory protein, which, after its pattern of expression is set up in seven stripes, regulates the expression of other Drosophila genes. As development proceeds, the embryo is thus subdivided into finer and finer regions that eventually give rise to the different body parts of the adult fly.
36
(No Transcript)
37
                                                
                   Figure 7-55. Close-up view
of the eve stripe 2 unit. The segment of the eve
gene control region identified in the previous
figure contains regulatory sequences, each of
which binds one or another of four gene
regulatory proteins. It is known from genetic
experiments that these four regulatory proteins
are responsible for the proper expression of eve
in stripe 2. Flies that are deficient in the two
gene activators Bicoid and Hunchback, for
example, fail to efficiently express eve in
stripe 2. In flies deficient in either of the two
gene repressors, Giant and Krüppel, stripe 2
expands and covers an abnormally broad region of
the embryo. The DNA-binding sites for these gene
regulatory proteins were determined by cloning
the genes encoding the proteins, overexpressing
the proteins in E. coli, purifying them, and
performing DNA-footprinting experiments as
described in Chapter 8. The top diagram indicates
that, in some cases, the binding sites for the
gene regulatory proteins overlap and the proteins
can compete for binding to the DNA. For example,
binding of Krüppel and binding of Bicoid to the
site at the far right are thought to be mutually
exclusive.
38
                               Figure 7-53.
The seven stripes of the protein encoded by the
even-skipped (eve) gene in a developing
Drosophila embryo. Two and one-half hours after
fertilization, the egg was fixed and stained with
antibodies that recognize the Eve protein (green)
and antibodies that recognize the Giant protein
(red). Where Eve and Giant proteins are both
present, the staining appears yellow. At this
stage in development, the egg contains
approximately 4000 nuclei. The Eve and Giant
proteins are both located in the nuclei, and the
Eve stripes are about four nuclei wide. The
staining pattern of the Giant protein is also
shown in Figure 7-52. (Courtesy of Michael
Levine.)
39
(No Transcript)
40
(No Transcript)
41
(No Transcript)
42
(No Transcript)
43
(No Transcript)