Pr

1
MICROBIOLOGÍA HIGIENE
Jean-Pierre VALADE Noviembre 2005
2
Higiene de la línea de vino

• Qué es la Higiene?
•  Todos los cuidados para garantizar la
  inocuidad, el buen estado de salubridad de los
  alimentos en todos los estados, después de la
  cosecha, la producción o la fabricación,hasta el
  consumidor final. 
• Noción de calidad higiénica respecto de la salud
• Noción de calidad productiva evitar las
  alteraciones.
• COnocimientos empíricos de higiéne
• Ejemplo Bebidas fermentadas.

3
Microbiología de la línea de vinos

• Microorganismos del vino
• Interés tecnológico
• Responsable de alteraciones
• ?Predominan la flora y sus actividades, técnicas
  de vinificación
• ?Elementos donde predomina la higiene

4
Microbiología de la línea de vinos

• Etimología (en griego)
• Mikros pequeños
• bios vida
• logos ciencia
• La microbiologia es el ensamble de disciplinas
  biológicas dedicadas al estudio de
  microorganismos.

5
Microbiología del vino
Los principales gérmenes encontrados en la
enología
Los mohos, presentes sobre los racimos y en las
cavas. Ellos no son jamás útiles y pueden
provocar malos sabores.

• Hongos filamentosos uni o multicelulares
• Organismos eucaryotes aeróbios
• Gran capacidad de diséminación

6
Microbiología del vino
Los mohos posibles alteraciones

• - Producción de 2,4,6 Tricloroanisol
• Olor a tierra, corcho enmohecido
• Mycotoxinas achratoxina A
• Cancerígeno
• Análisis por sondeo
• Norma europea

7
Microbiología del vino
Los principales gérmenes encontrados en la
enología
Las levaduras, responsables de la fermentación
alcohólica, más tambien da alteracioens( flor ,
fermentación en botellas).

• - Celula eucaryota
• hongo unicelular
• Reproducción por gemación o scissiparidad
• Tamaño 5 à 20 µm

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Microbiología del vino

• Las levaduras alteraciones posibles
• Durante la FA
• ? olores desagradables H2S, acidez acética,
  fenoles volátiles
• ? Carbamatos de etilo

• Durante el almacenamiento
• ? Velos sobre la superficie
• ? Refermentación en botellas

9
Microbiología del vino
Los principales gérmenes encontrados en la
enología
Las levaduras del género Brettanomyces, dan
origen a alteraciones de tipo aromáticas y gustos
animales

• - Célula eucaryota
• Hongo unicelular
• Reproducción por gemación
• Tamaño 2 à 20 µm

10
Microbiología del vino

• Las levaduras del género Brettanomyces
  alteraciones posibles
• Fenoles volátiles
• ? Etil-4-fenol (E4P)
• ? Etil-4-Gaïacol (E4G)
• Descriptores varios
• Animal, cuero, sudor de caballo, establo, aguado,

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Microbiología del vino
Los principales gérmenes encontrados en la
enología
Las bacterias lácticas, agentes de la
fermentación maloláctica, más causa
enfermedades(picadura láctica, tourne, grasa).

• - Célula procaryota es Gram
• Forma  cocoo  o  bastón 
• Metabolismo anaerobio
• Tamaño del orden del µm

12
Microbiologie du vin
Las bacterias lácticas posibles alteraciones

• - La enfermedad de la grasa
• Picadura láctica
• Degradación del ácido tartárico (tourne)
• Degradación del glicérol (amertume)
• Degradación del ácido sórbico (olor a geranio)
• Gusto a ratón
• Aminas biógenas

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Microbiología del vino
Los principales gérmenes presentes en la enología

• Las bacterias acéticas, efectos nefastos,
  responsables de la picadura acética.
• Célula procaryota es Gram -
• Forma  coccobacilo 
• Métabolismo aerobio estricto
• Tamaño del orden del µm

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Microbiología del vino
Las bacterias acéticas posibles alteraciones
-Picadura acética producción de acidez
acética ? Etanol se transforma en ácido acético
acetato de etilo
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Microbiología del vino
Tipo de microorganismo Desviación observada Factores de riesgo
Brettanomyces Fenoles volátiles Azúcares reciduales gt3g/L TC elevadas gt15C SO2 librelt25mg/L Falta de calrificación o filtración Higiene insuficiente pH elevado
Pediococcus Enfermedad de la grasa Azúcares reciduales gt3g/L TC elevadas gt15C SO2 librelt25mg/L Falta de calrificación o filtración Higiene insuficiente pH elevado
Bacterias acéticas Picadura acética Azúcares reciduales gt3g/L TC elevadas gt15C SO2 librelt25mg/L Falta de calrificación o filtración Higiene insuficiente pH elevado
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Microbiología del vino
Evolución de la población de Agregado de SO2 Agregado de Lysozima Aireación Anaerobiosis
Levaduras - 0 -
Bacterias Lácticas -- --- --
Bacterias acéticas - 0 --
acción favorable - acción desfavorable
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Higiene en la vendimia
Todos los microorganismos pueden desarrollarse
Azúcares humedad aire calor aucencia SO2
Precauciones a tener en cuenta ? Reducir el
tiempo de transporte de las uvas ? Limitar el
aplastamiento de las uvas ? Sulfitar el zumo
liberado ? Protección por iniertización (N2, CO2,
frío)
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Recepoción en la cuba
Todos los microorganismos pueden desarrollarse
Azúcares humedad aire calor aucencia SO2

• Higiene crusial más dificil
• Estudiar el sulfitado
• Sulfitado f(higiene)
• Sulfitar lo más pronto posible(se aconseja 6
  g/hL)

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Fermentación?
? Sin Manejo del conjunto de condiciones
? Manejo del conjunto de condiciones
Levaduras indígenas
Fermentación
Riesgos de cepas nefastas Desviaciones
organolépticas Ejemplo Brettanomyces
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Fermentación Interés
? Finalización rápida de la FA, evita crecimiento
de flora indesiable  manejo de la cinética de
la fermentación ? FA completa y producto
estable ? Evitar crecimiento de alteraciones del
tipo falsos gustos o el desarrollo de compuestos
del tipo carbamato de etilo
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Fermentación
? Fermentar lo antes posible ? Fermentar TODAS
las cubas con siembra de cepas seleccionadas ?
Trabajar en buenas concidiones de higiene ? SO2
libre cercano a 0 ? TC evitar los fríos y los
choque térmicos
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Fermentación
Eficacia de la fermentación en función de la
HIGIENE de la Bodega
Reporte de la siembra
Levaduras indígenas por ml Levures aportadas por ml Implatación exitosa
Buena Higiene 10 000 1 000 000 a 3 000 000 FA asegurada en 99,9 por levaduras aportadas
Higiene media 3 000 000 a 5 000 000 1 000 000 a 3 000 000 FA asegurada en 50/50 por lev.indígenas y LSA
Higiene deficiente 30 000 000 a 50 000 000 1 000 000 a 3 000 000 FA asegurada en 80/90 por lev indígenas
100
1
0,1
23
Fin de fermentación alcohólica
Si no se desea realizar fermentación
maloláctica ? Limpiar al vino ? Airear el vino ?
Sulfitar en 3-4 g/hL, regular según el pH, el TAV
y los niveles de población microbiana ? Dejar
bajar la temperatura por debajo de los 15C
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Siembra Bacteriana
? En el arranque de la FML controlar la cinética
fermentativa manejos permet une  mise au
propre  rapide des vins ? Evita el desarrollo de
Flora indígenay de problemáticas del tipo grasa,
limitación en los tenores de aminas biógenas
(Histaminas)
Pediococcus et lactobacillus
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Maîtrise des techniques avant mise
Chute de population en germes par millilitres Chute de population en germes par millilitres Chute de population en germes par millilitres
Traitement Levures Bactéries
Soutirage 102 102
Filtration Kieselguhr Terre blanche 102 à 103 Population très peu réduite
Collage sur vin rouge après FML 102 à 103 103
Filtration Kieselguhr Terre rose 102 102
Centrifugation 103 à 104 Population très peu réduite
Flash Pasteurisation 105 à 106 105 à 106
Brugirard Rochard 1991
26
Mise en Bouteilles
Moins de 0,1 germe vivant par mL Norme très stricte parfois exigée à lexportation
Moins de 2 germes vivants par mL Bonne mise en bouteilles pour le marché intérieur et lexportation
De 2 à 100 fermes vivants par mL Acceptable dans le cadre dun circuit de commercialisation court
De 100 à 10 000 germes vivants par mL Vin limpide à brillant instable. Risque important daltération microbienne
Normes usuelles de stabilité biologique pour un
vin sec embouteillé
27
Micro-organismes du vin
Pour se développer, un germe a besoin ?
Température ? Substrat ? Humidité ? pH ? Temps
28
Choix des produits
En fonction des supports
Matériel Produits utilisables Produits à proscrire
Inox Alcalins forts Ammonium quaternaires Alcalins chlorés Acide péracétique Acides forts Alcool 70 Eau de Javel Acide chlorhydrique Produits abrasifs
Béton Alcalins forts Alcalins chlorés Péroxyde Alcalin Acide Péracétique Ammoniums quaternaires (rinçage) Haute pression
Bois (nécessite un rinçage abondant) SO2 Alcalins Permanganate milieu acide Acides forts Ammoniums quaternaires Produits chlorés
29
Choix des produits
En fonction des micro-organismes
Bactéries lactiques Gram Bactéries acétiques Gram - Levures Moisissures
Composés chlorés
Eau oxygénée
Acide Péracétique
Ammoniums quaternaires
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Brettanomyces

• Que es la Brettanomyces?
• Levadura de alteracion frecuente
• Produccion de fenoles volatiles
• Contribuye a la complegidad aromatical
• Despues de una cierta concentracion el vino se
  torna desagradable para la mayoria de la gente

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Brettanomyces
Ecologia

• ? Bodega (valvulas, alcantarillas, madera)
• Equipamientos (matérial vitivinicolas, bombas)
• Caracteristicas morfologicas
• Polimorfo Tamano pequeño 2 a 6,5 µm
• Filtración - Porosidad

32
Brettanomyces
Fisiologia
? Produccion de acido acetico a partir del
azucar ? Produccion de acetato de etilo ?
Produccion de fenoles volatiles ? Fermentacion de
cellobiosa (barricas) ? Produccion de acidos
grassos (octa-, deca- y dodécanoico) ? Capacidad
de sobrevivir a concentraciones de etanol gt 13
y a temperaturas gt 30C
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Brettanomyces

• Condiciones de riesgo
• ? Azucar residual gt 3 g/L
• ? TC elevada gt 15C
• ? SO2 libre lt 25 mg/L
• ? Ausencia de clarificacion y filtracion
• ? pH elevado
• ? Higiene insuficiente
• Medio de control
• Higiene, SO2

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Brettanomyces
Proportions vins rouges 1 E4P/8-10
E4G Proportions vins blancs 1 E4P/4 E4G

• fenoles Volatiles
• Etil-4-Fenol (E4P)
• Etil-4-Gaiacol (E4G)
• Descriptores variados
• Animal, cuero, sudor de caballo, establo, tinta

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Brettanomyces
Phénols Volatils
36
Brettanomyces
Nivel de percepcion de lEtil-4-Fenol
Nivel de percepcion autor
450 µg/L Chatonnet et al., 1995
420 µg/L Ribéreau-Gayon et al., 1998
620 µg/L Loureiro Malfeito-Ferreira, 2003
37
Brettanomyces intérêts suivi en caves
Témoin 0,35g/L Glc SO2 14mg/L pH 3,75 EtOH
13,5 Saturation 02 6mg/L Oxygène 10
mL/L/mois OxygèneGlucose 10mL/L/mois 2 g/L
Glucose Glucose 2g/L Glucose
Brettanomyces (million UFC/mL)
Temps (jours)
Résultats Oenodev 2003
38
Brettanomyces interes de la concentracion en
bodega
Testigo Saturacion Oxigeno Oxigeno Glucosa Glucosa
Etil Gaiacol (µg/L) 260 250 240 400 440
Etil Fenol it (µg/L 1590 1700 1580 3090 4070
39
Brettanomyces intérêts suivi en caves
40
Brettanomyces Données Inter Rhône
Programme  Microflores daltération  3 vins/
31 présence de Btrettanomyces intermedius Observ
atoire Qualité 8 vins sur 13 jugés  animal 
éthyl phénols Audits Techniques
Brettanomyces Vin en cuve Sulfitage Vin en
cuve 14100 Brett/mL 3 Brett/100mL
SO2 libre 29 mg/L
41
Brettanomyces Toutes les régions
Bourgogne travaux de Vincent Gerbaux
167 Souches 35 Souches productrices de phénols
Levures isolées volatils. Brettanomyces
intermedius ? Phénols volatils altèrent le
caractère fruité des vins au profit de caractères
animaux ? Contamination artificielle capacité
des Brettanomyces à se développer très rapidement.
42
Brettanomyces Toutes les régions
Bourgogne travaux de Vincent Gerbaux

• ? Phénols volatils f(alcool TC sucres)
• ? Peu dinfluence du pH
• ? Vin avant FML est plus sensible quaprès FML
• ? 20 mg/L SO2 pas deffet sur les Brettanomyces
• ? 40 mg/L SO2 effet létal sur les Brettanomyces

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Brettanomyces Todas las regiones
Bordeaux travaux dAline Lonvaud
Barricas ? Mayoria de levadura en suspencion
Saccharomyces cerevisiae ? Mayoria de levaduras
dentro las lias Brettanomyces bruxellensis ?
Produccion importante de fenoles volatiles dentro
de un vino con lias / testigo
Vin Testigo Vin lias
E4P g/L 67 5060
E4G g/L 15 890
44
Brettanomyces Actions prévues
Outils Inter Rhône - Dosage des phénols
volatils (méthode twister) - Numération
Brettanomyces (en 7 jours) ? Possibilité de
réaliser des expertises  Brettanomyces  Mise
en place dun jury de dégustation
45
Diagnostic dhygiène
RLU
Plus il y a dATP, plus la production de lumière
est intense (URL)
ATP luciférine
luciférase
AMP luciférine-luciférase
1 photon
46
Diagnostic dhygiène
Point de contrôle Avant nettoyage Avant nettoyage Avant nettoyage Après nettoyage Après nettoyage Après nettoyage
Point de contrôle Bon Moyen Mauvais Bon Moyen Mauvais
Cuve de tirage Cuve de tirage Cuve de tirage Cuve de tirage Cuve de tirage Cuve de tirage Cuve de tirage
Arrivée du vin 683 89
Paroi 574 50
Couvercle 494 114
Matériel vinaire Matériel vinaire Matériel vinaire Matériel vinaire Matériel vinaire Matériel vinaire Matériel vinaire
Fond de cuve 114 39
Vanne de fond 9718 1204
Paroi latérale 48 40
Manche (Ø 50) 81841 5164
47
Epifluorescence Applications

• Dénombrement précis des levures et bactéries
  viables pour des FA languissantes déviantes
• Dénombrement des bactéries vaibles FML
  tardives ou languissantes
• Montée en volatile évaluation du risque
  biologique
• Contrôle microbiologique avant mise
  détermination du parcours de filtration

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Epifluorescence Méthode
Échantillon de vin
Filtration
Filtre
Marquage 1H30
Microscope avec dispositif amplification de
lumière
Tampon de marquage
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Conclusion

• Maîtrise de la microbiologie à toutes les étapes
• Hygiène adaptée bonne élaboration du vin
• Outils de validation de lhygiène et de contrôle
  microbiologique