RESONANCIA MAGN

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RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR

• Míriam Onrubia Laura Plaza Patricia Resa

2
Resonancia Magnética Nuclear

• La RMN es un fenómeno que ocurre cuando el núcleo
  de ciertos átomos inmersos en un campo magnético
  estático, son expuestos a un segundo campo
  magnético.
• 1H, 13C, 15N, 31P

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Características RMN

• Uso de muestras no cristalizadas ? estructura en
  solución
• Posibilidad de aplicar a moléculas sin cristales
  disponibles.
• Amplio rango de condiciones experimentales
• PDB 16 de proteínas determinadas por RMN
• Determinación de estructuras de tamaño limitado
  (35-40 KDa)

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Mecánica Clásica y Cuántica

• µ momento magnético dipolar
• B Campo magnético
• e carga del e-
• m massa del átomo o e-
• L S momentos angulares
• ? cte giromagnética
• M magnetización
• ml momento angular de spin

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Mecánica Cuántica
Niveles cuánticos de la energía en B0
DE
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Orientación de los spins
B0
7
Población de niveles energéticos
Frecuencia de Larmor
8
Aplicación de B1
B0
B1
9
Relajación
10
Ecuaciones de Bloch
11
Ecuaciones de Bloch
Soluciones
12
Representación de las ecuaciones de Bloch
13
Ecuaciones de Bloch
Soluciones
14
Relajación
T1

• T1 longitudinal relaxation time o spin-lattice
  relaxation time
• T2 transverse relaxation time o spin-spin
  relaxation time
• T2 ? T1

T2
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Recoger la señalFree Induction Decay (FID)
Señal Función de onda para cada sistema
spin Frecuencias
Transformada de Fourier
16
RNM unidimensional
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Determinación estructural de proteínas para RMN

• Proteínas pequeñas (lt 10 kDa)
• RMN bidimensional basada en experimentos de 1H
• La estructura se puede obtener sin necesidad de
  enriquecimiento isotópico.
• Proteínas pequeñas-medianas (lt 20 kDa)
• Marcaje isotópico (15N i 13C)
• Experimentos de RMN multidimensionales (3D) de
  triple resonancia (1H/13C/15N)
• Proteínas grandes (gt 20 kDa)
• Marcaje isotópico (15N i 13C) deuteración
  (50-70 2H)
• Experimentos de RMN multidimensionales (3D i 4D)
  de triple resonancia (1H/13C/15N) sofisticados

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RMN bidimensional

1. Obtención de los espectros de COSY, TOCSY y
   NOESY.
2. Asignación determinar que Aa hay en los
   espectros
3. Determinación de las distancias entre Aa
4. Reconstrucción 3D

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COSY

• Identifica los sistemas de spin característicos
  de los aminoácidos.
• Permite, por tanto, identificar los aminoácidos.

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COSY
CH3-CH2-OH
90º
90º
t1 t2 t3 t4
TF
90º
90º
TF
90º
90º
TF
90º
90º
TF
21
COSY
22
(No Transcript)
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NOESY

• Técnica para correlacionar núcleos en el espacio
  que se encuentran a una distancia menor de 5Å.
• La diferencia entre los espectros con y sin
  efecto NOE da lugar al espectro NOESY. Cuanto
  mayor es el efecto menor es la distancia.
• Permite la identificación de la posición
  específica de cada aminoácido en la secuencia.

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Efecto NOE Nuclear Overhauser Effect

• La irradiación sobre un núcleo produce
  variaciones en la resonancia en los núcleos
  vecinos.
• Condiciones
• distancia lt 5Å
• Saturación de la resonancia

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RMN bidimensional

1. Obtención de los espectros de COSY, TOCSY y
   NOESY.
2. Asignación determinar que Aa hay en los
   espectros
3. Determinación de las distancias entre Aa
4. Reconstrucción 3D

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Asignación

• Identificar tipos de Aa en COSY y TOCSY
• Identificar en NOESY los Aa de la secuencia
• Desplazamientos químicos en COSY

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Asignación de los sistemas de spin de los Aa
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Asignación de los sistemas de spin de los Aa

• Experimento 2D COSY (COrrelation
  SpectroscopY)

• Experiment 2D TOCSY (TOtal Correlation
  SpectroscopY)

29
Asignación de los sistemas de spin de los Aa
CHbi
O
CHbi1
O
Ni
Cai
Ci
Ni1
Cai1
Ci1
Ni2
H
Ha
H
Ha
H
picos correlación TOCSY, COSY
30
Asignación de los sistemas de spin de los Aa
31
Asignación de los sistemas de spin de los Aa

• Experiment 2D NOESY (Nuclear Overhauser
  Effect SpectroscopY)

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y al final de la asignación ...
33
RMN bidimensional

1. Obtención de los espectros de COSY, TOCSY y
   NOESY.
2. Asignación determinar que Aa hay en los
   espectros
3. Determinación de las distancias entre Aa
4. Reconstrucción 3D

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Determinación de las distancias entre Aa

• NOE ? distancias
• NOEs intensos 1.8 lt rHH lt 2.8 Å
• NOEs medios 1.8 lt rHH lt 3.5 Å
• NOEs débiles 1.8 lt rHH lt 5 Å

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RMN bidimensional

1. Obtención de los espectros de COSY, TOCSY y
   NOESY.
2. Asignación determinar que Aa hay en los
   espectros
3. Determinación de las distancias entre Aa
4. Reconstrucción 3D

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Reconstrucción 3D
ángulos diedros
puentes disulfuro
restricciones experimentales
límites de distancias entre 1H
Coordenadas De los átomos de la proteína
Secuencia proteína
Longitudes y ángulos de enlace
quiralidad, planaridad
Interacciones no covalentes van der Waals,
electrostáticas, enlaces dH
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Estructura de proteínas
enlace
38
Estructura de proteínas
ángulo
enlace
39
Estructura de proteínas
dihedro
ángulo
enlace
40
Estructura de proteínas
dihedro
ángulo
enlace
van der Waals
41
Estructura de proteínas
dihedro
ángulo
enlace

-
electrostático
van der Waals
42
Estructura de proteínas
dihedro
puente de hidrógeno
ángulo
enlace

-
electrostático
van der Waals
43
Estructura de proteínas
puente de hidrógeno

-
electrostático
van der Waals
44
(No Transcript)
45
Fin de la presentación, haga click si tiene dudas
46
Parámetros espectrales con información sobre la
estructura secundaria de la proteína

• NOE
• Constantes de acoplamiento (J)
• Desplazamientos químicos (d)
• Velocidades de intercambio H D
• Coeficientes de temperatura

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Parámetros espectrales con información sobre la
estructura secundaria de la proteína

• NOE La irradiación sobre un núcleo produce
  variaciones en la resonancia en los núcleos
  vecinos.
• Condiciones
• distancia lt 5Å
• Saturación de la resonancia para igualar estados
  alfa y beta.
• Es el método de elucidación de características
  estructurales en 3D y estereoquímica, usando RMN
  junto con información de los acoplamientos
  escalares spin-spin.

48
Parámetros espectrales con información sobre la
estructura secundaria de la proteína

• Constantes de acoplamiento spin-spin (J)
• Las interacciones escalares entre núcleos unidos
  a través de un pequeño número de enlaces
  covalentes causan desacoplamiento en las señales
  de RMN.
• Dependen de la geometría de los enlaces que unen
  los spins nucleares.

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Parámetros espectrales con información sobre la
estructura secundaria de la proteína

• Desplazamientos químicos (d)
• Los diferentes protones de una molécula
  presentan frecuencias de resonancia
  característica en función de su entorno químico.

50
Parámetros espectrales con información sobre la
estructura secundaria de la proteína

• Velocidades de intercambio 1H 2H
• 5. Coeficientes de temperatura permite saber
  si se forman puentes de hidrógeno
  intramoleculares.

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1.Cita las características más importantes de la
técnica RMN y su definición.La RMN es un
fenómeno q ocurre cuando el núcleo de ciertos
átomos inmersos en un campo magnético estático,
son expuestos a un segundo campo magnético. Solo
sufren este fenómeno los núcleos que tiene la
propiedad llamada SPIN. Núcleos q tienen esta
propiedad de spin son 1H, 13C, 15N. Solo los q
tienen spin distinto de 0 son detectables por
RMN.  Características- Las estructuras a
estudiar están en solución, como suelen estar en
su medio habitual.- Posibilidad de aplicar a
moléculas sin cristales disponibles.- Amplio
rango de condiciones experimentales. Esto permite
aumentar las posibilidades de estudios
comparativos en soluciones de condiciones
naturales o desnaturalizantes.- También se
pueden estudiar con esta técnica proteínas no
solubles con RMN sólido o con micelas. (para por
ejemplo el estudio de prot. Transmembrana).-
PDB 16 de proteínas determinadas por RMN -
Determinación de estructuras de tamaño limitado
(35-40 KDa)
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2. En que consiste el efecto NOE y que
aplicaciones podemos encontrarle?Efecto NOE la
saturación de un sistema spin mediante
irradiación producirá variaciones en la señal
emitida por los sistemas spin vecinos. Se basa
en saturar uno de los sistemas spin de la
muestra. Si seguimos irradiando este sistema spin
concreto durante un periodo de tiempo más largo,
este no puede absorber esta energía de más y la
cede a los sistema spin vecinos situados a menos
de 5 amstrongs que sí podrán absorber esta
energía. Comparando las frecuencias obtenidas
habiendo producido o no efecto NOE, podremos
deducir que sistemas spin están a 5 amstrongs o
menos de distancia. Aplicaciones? Experimento
NOESY Nos permite comparar espectros obtenidos
habiendo producido el efecto NOE y sin
producirlo, de manera que podemos comparar que
sistemas de spin quedan afectados por otros
sistemas de spin cercanos. Teniendo en cuenta
que cada aminoácido tienen un sistema de spin
característico, podemos relacionar sistemas spins
vecinos separados por enlaces peptídicos (?doble
enlace), es decir, podemos relacionar aminoácidos
vecinos. Esto nos permite conocer la secuencia de
una proteína. 
53

• PEM
• 1. Señala les opciones correctas
• a)      Solo los átomos con sistema de spin
  diferente de 0 son detectables por RMN.
• b)      Tienen propiedad de spin los átomos con
  un número de electrones impar y/o con un número
  de neutrones impar.
• c)      Las dos anteriores son correctas.
• d)      Cualquier tipo de átomo presenta
  propiedad de spin.
• e)      Todas las anteriores son correctas.
•  
•  
• 2. Señala las verdaderas. Sobre RMN (Resonancia
  Magnético Nuclear)...
• Una de las principales ventajas del RMN es que no
  es necesario cristalizar la molécula en estudio.
• Se pueden hacer RMN en medio sólido.
• El hecho de que se puedan hacer RMN con micelas,
  permite el estudio de proteínas transmembrana en
  un medio similar al que se encuentran en
  condiciones normales.
• Uno de los principales inconvenientes es que el
  tamaño de las proteínas que se pueden estudiar es
  limitado.
•  
• a)      1, 2 i 3
• b)      1 i 3
• c)      2 i 4
• d)      4.

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• 4. Indica la opción correcta. El RMN
  unidimensional nos sirve para...
•  
• a)      Determinar si existe mucho solapamiento
  entre frecuencias, indicando si debemos hacer RMN
  3D.
• b)      Se usa como indicativo de la calidad que
  tendrá el estudio en 2D.
• c)      Indica frecuencias y su posición depende
  del desplazamiento químico.
• d)      Todas las anteriores son correctas.
• e)      Ninguna de las anteriores es correcta.
•  
•  
• 5. Señala la afirmación incorrecta
• a)      Las ecuaciones de Bloch describen la
  relajación del sistema de spin al dejar de
  aplicar el segundo campo magnético
• b)      La frecuencia a la que precesan (giran)
  los sistemas de spin es completamente
  irrelevante.
• c)      El nivel energético en el que se
  encuentre un átomo sometido a una campo magnético
  depende del momento angular de spin.
• d)      El momento magnético bipolar (?) es
  directamente proporcional a la carga e
  inversamente proporcional a la masa.
• e)      Todas las anteriores son correctas.
•  
•  
•  

55

•  
• 7. Indica las verdaderas.
• a)      Un experimento NOESY proporciona más
  información que uno COSY.
• b)      El primer paso del análisis de los
  resultados de los experimentos de RMN es la
  asignación ( saber cada sistema de spin a que
  aminoácido corresponde).
• c)      Las dos anteriores son correctas.
• d)      El experimento NOESY nos proporciona las
  restricciones de distancia entre amnoácidos, de
  manera que es el que realmente nos da la
  información sobre la estructura secundaria y
  terciaria de la proteína.
• e)      Todas las anteriores son correctas.
•  
• 8. En el experimento NOESY
• 1.      Dado que las proteínas tienen cierto
  movimiento en solución, las distancias no van a
  ser números exactos
• 2.      La lista de distancias obtenidas con un
  NOESY va a ser esencial para hacer la
  reconstrucción 3D.
• 3.      Se utilizan una serie de rangos para
  definir las distancias entre sistemas de spin, el
  mínimo de los cuales coincide con la suma de los
  radios de las fuerzas de Van der Wals.
• 4.     Cuanto más intenso sea el pico obtenido en
  un espectro NOESY, más lejos están los
  aminoácidos implicados.
•  
• a)     1, 2 i 3
• b)     1 i 3
• c)      2 i 4
• d)     4
• e)      1, 2, 3 i 4

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•  
• 10. En cuanto a la asignación en RMN
•  
• 1.      Con los espectros de COSY identificaremos
  qué y cuántos aminoácidos hay en nuestra proteína
  problema.
• 2.      El NOESY nos permitirá determinar los
  aminoácidos vecinos por estructura y por
  secuencia.
• 3.      El NOESY es útil para distinguir entre
  hélices alfa y beta.
• 4.      Cada aminoácido tiene una distribución de
  picos característica en un espectro COSY.
•  
• a)      1, 2 i 3
• b)      1 i 3
• c)      2 i 4
• d)      4.
• e)      1, 2, 3 i 4
•