A Toll-like receptor ok szerepe diabetes mellitusban

1
A Toll-like receptor ok szerepe diabetes
mellitusban

• dr. Reismann Péter
• Semmelweis Egyetem
• II.sz. Belgyógyászati Klinika

2

• A szervezet védekezo rendszere

• Szerzett immunválasz
• tanult
• specifikusabb
• lassabb folyamat

• Természetes immunválasz
• - veleszületett, általánosabb
• aktiválódásakor akut fázis reakciót indít el
• - gyulladásos folyamat indul be

3
Toll receptor Toll-like receptor
1985 dorso-ventralis fejlodés Antifungalis-
antimikróbás feladat
4
PAMP-PRR

• PAMP pathogen associated molecular
  pattern
• 
  kórokozóhoz kapcsolt molekuláris minta
• DAMP danger associated molecular
  pattern
• veszélyhez asszociált
  molekuláris mintázat
• PRR pattern recognition receptor
• minta felismero receptor

5
Toll-like receptorok
6
Toll-like receptor
Interleukin-1 szupercsalád az intracelluláris
homológia miatt 1-es típusú transzmembrán
protein 21 leucinban gazdag motívum, amely a
ligandkötésben és a dimeralizációban vesz részt.
7
RSV F-protein
TLR-4
oxLDL
Szabad zsírsav
Taxol
Fibrinogén, fibronektin
LPS
Hsp 60 and 70
CD14
MD-2
MyD88
TRIF
citoplazma
IRF3
IRAK
TRAF-6
MKK
NEMO (IKKg)
IKK complex
IKKb
IKKa
JNK
IL-1, IL-6, TNF-a
IKB
NF-KB
sejtmag
AP-1
NF-KB
8
TLR aktiváció a T-sejteken

• TLR expresszió mind az antigén prezentáló
  sejteken, mind a Treg sejteken! Autoimmun és
  gyulladásos folyamat szabályozás már az
  aktiváció elején elindítja a folyamat
  szabályozott csillapítását!

9
Toll-like receptorok és diabetes

• 1-es típusú diabetes mellitus proinflammatorikus
  áll.
• Monocyta TLR2 és TLR4 expresszió és aktiváció
  fokozott T1DM-ben
• TLR2 és TLR4 ligandok szintje emelkedett
  T1DM-ben, mint a Endotoxin lipopolysaccharid
• Hsp60- heat shock protein 60
• HMB1- high mobility group boksz 1 késoi
  sepsis gyulladásos mediator

10
TLR2 és 4 ligandok 1-es típusú DM
  Controls (n??37) Type 1 diabetes (n??34)
Endotoxin (nmol/l) 2.53??0.67 3.32??0.82
HMGB1 (nmol/l) 0.13??0.04 0.20??0.06
Hsp60 (pmol/l) 18.5??5.0 23.2??6.7
GAS6 (nmol/l) 11.2??6.9 10.2??5.9
Table 2 Levels of ligands of TLR2 and TLR4 Data
are expressed as mean??SD p?lt?0.01 vs controls
11
Inzulin hatása a TLR expresszióra
A hyperglycaemia elosegíti, az inzulinkezelés
csökkenti a TLR-ek expresszióját
12
Vírus precipitálta diabetes

• BioBreeding diabetes rezisztens (BB-DR)
  patkányoknál diabetes jelentkezett, ha Kliham rat
  vírussal (KLV) fertozték meg. A KLV egy egyszálú
  DNS parvovírus.
• A vírus nem közvetlenül a pancreast fertozi meg,
  hanem megváltoztatja az egyensúlyt a pathogének
  és a szabálozó sejtek arányát, foként a
  CD4CD45RClo sejtek arányát. Továbbá, ha a
  fertozés mellé TLR aktiváló ligandokat is adnak,
  akkor a 23-os arányú csak vírus indukálta
  diabetes arány 50-100 közé emelkedik a különbözo
  TLR ligandoktól függoen.
• Ezenfelül a NOD TLR2-/- egereknél a diabetes
  incidendia 50-kal csökken a NOD TLR2/-hoz
  képest.

13
TLR4 és inzulin rezisztencia

• obezitás ? inzulin rezisztencia
• Obesitás - - krónikus proinflammatórikus állapot
• Lymphocyta beszurodés a zsírsejtek körül a
  zsírszövetben. Fokozott proinflammatórikus
  citokin szint a zsírszövetben és a keringésben
  (pl. TNFa, IL-6)
• De hogy mi váltja ki, még nem teljes mértékben
  ismert!
• a keringo zsírsavak szintje túlsúlyosságban
  emelkedett, és a zsírsavak emelik a proinflamm.
  citokinek szintjét
• Az egyik kapocs TLR4

14
TLR4 és szabad zsírsav
Szabad zsírsav fokozza a TLR4 aktivációt
TLR4 expresszió növekszik obesitásban
15
TLR4 és szabad zsírsav
16
TLR4 és inzulin rezisztencia
17
TLR4 és inzulin rezisztencia

• Monocyta-adipocyta sejtkultura

TLR4-ligand
TLR4
monocyta
inzulin
Proinflammatorikus cytokinek
adipocyta
Inzulin receptor
GLUT4
IRS
18
Diabetes és diabeteses szövodmények
?
RAGE
TLR4
PRR pattern recognition receptor
Természetes immunválasz
19
A TLR4 gén polimorfizmusa 9q32-33, két gyakori
koszegregációs polimorfizmus (10)

• cDNS-en start kodontól 3 irányba 896.
  pozícióban
• Adenin Guanin
• 299. pozícióban Asparaginsav Glicin
• cDNS-en start kodontól 3 irányba 1196.
  pozícióban
• Citozin Timin
• 399. pozícióban Threonin
  Izoleucin

20
TLR4 gén polimorfizmus hatása

• Az extracelluláris régiót érinti
• a-helikális struktúra felbomlik,
• b-fonal alakzattá alakul át
• A helyi töltési viszonyok változnak
• Zavart okozhat a TLR4 sejtmembránba szállításába
• Zavart okozhat a receptor-ligand
• kapcsolódásakor
• Zavart okozhat a co-receptorok megkötésében

21
TLR4 gén polimorfizmus klinikai jelentosége

• csökkenti a belégzett LPS-re létrejövo
  válaszreakciót
•      Arbour N et al TLR4 mutations are associated
  with endotoxin hyporesponsiveness in humans.
  Nature Genetic 25187-191, 2000

• növeli az esélyét Gram-negatív baktériumok okozta
  fertozésnek
• Schwartz DA TLR4 and LPS hyporesponsiveness in
  humans. Int J Hyg Environ Health 205221-7, 2002

- csökkenti a carotis-atheroszklerózis
rizikóját  Kiechl S, Lorenz E, Reindl M,
Wiedermann CJ, Oberhollenzer F, Bonora E, Willeit
J, Schwartz DA Toll-like receptor 4
polymorphisms and atherogenesis. New Engl J Med
347185-92, 2002

• növeli a pravastatin kardioprotektív hatását
• Boekholdt SM, Agema WRP, Peters RJG, Zwinderman
  AH, van der Wall EE, Reitsma PH, Kastelein JJP,
  Jukema JW, REGRESS Study Group Variants of Toll
  like Receptor 4 modify the efficacy of statin
  therapy and the risk of cardiovascular events.
  Circulation 1072416-2421, 2003

TLR4 hatása nem fertozo eredetu, de krónikus
gyulladásos folyamatokban?
22
I. Diabetes mellitus és a természetes immunitás

• 1-es típusú DM TLR függo interferon-a aktiváció
  insulinitist okoz
• 2-es típusú DM akut fázis reakció, krónikus
  gyulladás, akut fázis proteinek (CRP, IL-6)
• Szövodmények

Intracelluláris stressz, Nf-kB aktiváció
23
Diabetes és TLR4

• Kérdésfelvetés és célkituzés
• A TLR4 gén Asp299Gly/Thr399Ile funkcionális
  polimorfizmus vizsgálata
• 1-es és 2-es típusú cukorbetegségben
• a diabeteses nephropathia és a perifériás
  neuropathiaval összefüggésben

24
Diabetes és TLR4
Módszerek Genotipizálás

• A polimorfizmus meghatározása PCR és restrikciós
  endonukleáz felhasználásával történt
• PCR-hez polimorfizmusra specifikus primerek
• Hasítás
• Asp2999Gly esetén NcoI
• Thr399Ile esetén HinfI endonukleázzal
  történt

25
Genotipizálás
Diabetes és TLR4
1 2 3 4 5 6 7 8
Vad típus
Asp299Gly
1 2 3 4 5 6 7 8
Vad típus
Thr399Ile
26
Beteg kiválasztás
Diabetes és TLR4

• diabeteses járóbeteg rendelésen megjelent 1-es
  és 2-es típusú diabetes mellitusban szenvedo
  betegek
• elozetes írásbeli beleegyezo nyilatkozat
• egyetemi etikai bizottság engedélyével
• részletes antopometriai, fizikai állapot,
  anyagcsere állapot felmérés

27
Diabetes és TLR4 eredmény
1-es típusú DM 2-es típusú DM
Heterozigóta Asp299Gly/Thr399Ile 26 / 246 (HA 10.6) 65 / 530 (HA 12.3)
Homozigóta Gly299Gly/Ile399Ile 0 1 / 530 (HA 0.2 )
Nincs szignifikáns különbség (p 0.63)
HA hordozási arány
28
1-es típusú diabetes 1-es típusú diabetes 1-es típusú diabetes 2-es típusú diabetes 2-es típusú diabetes 2-es típusú diabetes
Vad típus Asp299Gly Thr399ILe p-érték Vad típus Asp299Gly Thr399ILe p-érték
n 220 n 26 n 465 n 65
Diabetes idotartalma (év) 19 7.929.7 21 19.322.7 0.44 12 10.712.3 11 8.612.8 0.45
Nok aránya () 50.0 43.456.6 42.3 23.361.3 0.54 43.9 39.448.4 45.3 33.157.5 0.79
Életkor (év) 47 45,448.6 50 4456 0.51 66 64.566.5 64 61.266.4 0.15
Dohányzás () 26.5 19.533.5 23.8 5.642.0 1.00 25.5 20.630.5 24.3 10.538.1 1.00
Magas vérnyomás() 32.7 26.538.9 26.9 9.944.0 0.66 71.8 67.775.9 65.6 54.077.3 0.38
HbA1c érték () 7.3 7.07.6 7.1 6.57.6 0.54 7.3 7.27.4 7.0 6.77.3 0.19
Koleszterin szint (mmol/l) 4.9 4.85.1 5.0 4.65.3 0.94 5.1 4.95.2 4.9 4.65.3 0.49
Triglicerid szint (mmol/ll) 1.1 0.91.2 0.9 0.71.1 0.48 1.9 1.82.0 1.9 1.62.3 0.86
BMI 25.6 21.329.9 24.7 21.328.1 0.79 31.3 26.036.6 34.4 29.539.3 0.49
29
Diabetes és TLR4 eredmény
Polim.
Vad
Vad
Vad
Vad
Polim.
Polim.
Polim.
2-es típusú DM
2-es típusú DM
1-es típusú DM
1-es típusú DM
30
KövetkeztetésekI. vizsgálat Diabetes és TLR4

• Közvetlen összefüggést a TLR4 gén polimorfizmusa
  és a diabetes mellitus típusa között nem
  találtunk.
• Szoros összefüggés mutatkozott a TLR4 gén
  polimorfizmusa és a polyneuropathia elofordulása
  között 2-es típusú diabetes mellitusban. Hasonló
  összefüggést 1-es típusú DM-ben, vagy
  nephropathiával kapcsolatban nem tudtunk
  kimutatni.

31
KövetkeztetésekI. vizsgálat Diabetes és TLR4

• A diabeteses polyneuropathia pathogenesise
  különbözhet az 1-es és a 2-es típúsú DM-ben
• A természetes immunválasz szerepet játszhat a
  2-es típusú DM polyneuropathiájának
  kialakításában?

32
Köszönöm a figyelmüket!