Ve

1

• Veža veidošanas molekularie mehanismi
• Vezis šunu limeni genetiska slimiba
• Veža genoma izpete
• Veža šunu fiziologiskas ipašibas
• Veža šunu heterogenitate un cilmes šunas
• Iedzimta veža predispozicija
• Molekularie biomarkieri

Dr. Aija Line, BMC
2
Veža petniecibas virzieni
Fundamentalie Translacijas Kliniskie petijumi
Testu izstrade
Genoms epigenoms
Signalcelu izpete
Zalu vielu dizains
Starpšunu mijiedarbibas
Biomarkieru atklašana
Jaunas terapijas strategijas
Zalu un biomarkieru kliniskie izmeginajumi
Molekularie mehanismi
Jaunu zalu merku izpete
Zalu testešana
Merkis prevencija, labaka diagnostika,
efektivaka arstešana un pacientu dzives
kvalitates uzlabošana
3
Vezis ir otrs biežakais priekšlaicigas naves
celonis - katrs trešais savas dzives laika ar to
saslimst, katrs piektais no ta mirst. Ik gadu
pasaule gt 10 miljoni cilveku saslimst un gt7.6
miljoni mirst ar vezi
4
Saslimstiba un mirstiba no dažadiem veža veidiem
viriešiem Eiropa un Latvija (2008. gada)
Eiropa
Latvija
5
Saslimstiba un mirstiba no dažadiem veža veidiem
sievietem Eiropa un Latvija (2008. gada)
Eiropa
Latvija
6
Šunu limeni vezis ir genetiska slimiba
Vezis veidojas, somatiskajas šunas uzkrajoties
genetiskam un epigenetiskam izmainam, kas tam
nodrošina specifiskas fenotipiskas ipašibas un
selektivas priekšrocibas. Parasti veža
veidošanas procesa ir nepieciešamas izmainas
vairakos genos.
7
Audzeju veidošanos izraisa izmainas divu tipu
genos - onkogenos un audzeju supresor- genos
Pašlaik zinami 487 geni, kuros ir atrastas
dažada veida mutacijas un ir funkcionali
iesaistiti veža veidošanas procesa
8
Onkogeni -
Geni, kuru kodetie proteini mutaciju rezultata
klust konstitutivi aktivi vai tiek produceti
paaugstinata daudzuma, un spej izraisit šunu
transformaciju vai veicinat audzeja progresiju
(parasti - dominanti) Atbilstošais normalais
šunas gens proto-onkogens Funkcionali tie ir
dažadi proteini augšanas faktori vai to
receptori, apoptozes inhibitori, signalu
transdukcijas molekulas u.c.
9
Onkogenus var aktivet

• Punktveida mutacijas ? hiperaktivs proteins
  (RAS, BRAF)
• Genu amplifikacija ? normala proteina
  parprodukcija (AKT2, MYC)
• Hromosomalas translokacijas
• Paaugstinats ekspresijas limenis (BCL2)
• Paaugstinata proteina aktivitate (BCR-ABL)
• Epigenetiskas izmainas
• DNS hipometilešana (Ciklins D2, RAS)
• Hromatina remodelešana (CDKN2A)
• Dažus onkogenus parnes retrovirusi (HTLV1)
• Retrovirusu insercija saimniekšunas genoma
  proto-onkogenu tuvuma ? paaugstinata ekspresija
  (LMO2)

10
Audzeju supresor- geni
Geni, kuru normala funkcija ir nepielaut / kavet
audzeju veidošanos / progresiju. Mutacijas šajos
genos inaktive to kodetos proteinus, tadejadi dod
iespeju veidoties audzejam Funkcionali audzeju
suprosor-geni ir šunas cikla regulatori,
kontrolpunktu proteini, DNS bojajumu sensori,
apoptozes veicinataji u.c. Genetiskas
stabilitates geni (DNS reparacijas enzimi,
enzimi, kas piedalas hromosomu segregacija u.c.)
Visbiežak recesivi, tacu var but
haplo-nepietiekami
11
Audzeju supresor- genu inaktivacijas mehanismi
Non-disjunction, mitotic recombination or deletion
Mutation, LOH
Classical Knudson two-hit model
DNA methylation
12
Cik mutaciju ir katra individuala audzeja?
Greenman C et al (Nature, 2007) nosekvene 518
proteinkinazes kodejošus genus 210 dažados
audzejos. Kopuma atrod 1007 dažadas mutacijas,
bet to biežums dažados audzejos ir loti
atškirigs. Pleasance ED et al (Nature, 2010)
pilniba nosekvene metastatiskas melanomas šunu
linijas genomu - atrod 33 345 bažu nomainas, 292
no tam kodejošajos rajonos, lielaka dala
CgtT/GgtA tranzicijas UV starojuma izraisiti DNS
bojajumi, 66 insercijas/delecijas un 37 lielas
strukturalas izmainas. Ne visas mutacijas ir
funkcionali svarigas/iesaistitas audzeju
veidošana ir driver un passenger mutacijas
13

• Salidzina somatisko mutaciju spektru primara un
  metastatiska melanomas audu parauga (acral)
• atrod 6164 SNVs primaraja un 5582 SNVs
  metastatiskaja audzeja
• videjais mutaciju biežums primaraja audzeja
  2.16/Mb, metastatiskja 1.95/Mb
• ieverojami zemaks eksonos, ka starpgenu rajonos
  transcription coupled repair!
• dominejošais mutaciju veids CgtT tranzicijas (UV
  starojuma izraisiti DNS bojajumi vai DNS
  reparacijas enzimu mutaciju rezultats).
• metastatiskaja audzeja atrod tikai 2 SNV, kas nav
  primaraja.

14

• Analize 103 kruts veža paraugus, izmantojot
  eksoma sekvenešanu
• Atrod 4985 somatiskas mutacijas kodejošajos
  rajonos 14 - 307 mutacijas katra audzeja
  videjais mutaciju biežums 1.66/Mb biežakas
  TP53, PIK3CA, AKT1 u.c.
• Atrod jaunas funkcionali nozimigas mutacijas CBFB
  gena un MAGI3-AKT3 translokaciju jauni zalu
  merki

15

• Izmantojot eksoma sekvenešanu, metilešanas
  analizi un mRNS un miRNS profilešanu, analize 224
  kolorektalo audzeju genomus
• Mutaciju biežums varie no lt1/Mb lidz gt100/Mb
• 16 audzeju hipermuteti (gt8.24/Mb) saistiti
  ar MSI un DNS reparacijas enzimu inaktivaciju
• Biežas mutacijas 32 genos
• gt94 atrod mutacijas WNT signalcela nozimigs
  terapijas merkis

16
Starptautiskais veža genoma izpetes konsorcijs
17
Veža somatisko mutaciju katalogs
COSMIC (http//www.sanger.ac.uk/cosmic/)
18
Veža somatisko mutaciju katalogs COSMIC
19
Douglas Hanahan Robert Weinberg
(2000/2011) The Hallmarks of Cancer
20
(1) Audzeju šunam nav nepieciešami areji augšanas
signali
Normalam šunam ir nepieciešami augšanas signali
(augšanas faktori, signali no ECM, starpšunu
kontakti u.c.), lai tas proliferetu. Audzeju
šunas var proliferet bez arejiem signaliem.

• Veidi, ka audzeji nodrošina augšanas signalus
• Produce augšanas faktorus (PDGF, EGF, TGF u.c.),
  kas darbojas autokrina vai parakrina veida
• Pastiprinati produce augšanas faktoru receptorus
  (EGF-R, HER2/neu)
• Konstitutivi aktivi mitogeno signalu parnese celi
  (SOS-Ras-Raf-MAPK kaskade piemeram, 40
  melanomas gadijumu ir atrastas aktivejošas
  mutacijas B-Raf gena)

21
(2) Audzeju šunas inaktive proliferaciju
inhibejošos signalus
Lielakaja dala audzeju ir inaktivets pRb signalu
parneses celš, tikai atškiras veids, ka tas tiek
panakts mutacijas pRb, p16 mutacijas, ciklinu
parprodukcija u.c.
22
(3) Audzeju šunas izvairas no apotozes

• Audzeju šunas izvairas no apotozes, inaktivejot
  tas sensorus vai efektorus. Piemeram
• Paaugstinata BCL-2 ekspresija. BCL-2 ir
  intracelulars apoptozes inhibitors, kas bloke
  citohroma C izplušanu no mitohondrijiem.
• Paaugstinata anti-apototisko izdzivošanas
  faktoru, piemeram, survivin produkcija
• P53 inaktivacija mutaciju rezultata. P53 ir
  galvenais DNS bojajumu sensors.

23
(4) Audzeju šunam ir neierobežots replikacijas
potencials
Normalas šunas dalas 50-70 reižu ? replikativa
šunu senescence Telomeras - 10 000nt gari
GGGTTA atkartojumi hromosomu galos pec katras
replikacijas saisinas par 50-100nt 85-90
audzeju produce telomerazi enzimu, kas atjauno
telomeru garumu parejos gadijumos
starphromosomu rekombinacijas
24
(5) Audzeji spej inducet angiogenezi
Produce VEGF endotelialo šunu augšanas faktors
un anti-apoptotisks signals Nomac angiogenezes
inhibitorus angiostatinu un trombospondinu.
25
(6) Audu invazija un metastažu veidošana

• Daudzpakapju process, kas ietver
• Audzeju šunu invaziju, izklušanu cauri bazalajai
  membranai un saistaudiem
• Ieklušanu asinsvada / limfmezgla
• Izdzivošanu asinsrite
• Piestiprinašanos asinsvada sieninai,
  ekstravazaciju
• Sekundara audzeja veidošanos
• Mazak ka 1 no 1000 šunam, kas ieklust asinsrite
  izveido sekundaru audzeju
• Nodrošina izmainas starpšunu un šunu-ECM
  kontaktos (E-kadherina zudums, izmainas CD44
  ekspresija u.c.), ekstracelularo proteažu
  ekspresija (MMPs, uPA u.c.) un to dabisko
  inhibitoru inaktivacija utt

26
(7) Energijas metabolisma parprogrammešana
Matthew G Vander Heiden et al, Science 2009
Warburga efekts veža šunas, ari O2 klatbutne,
energiju iegust, galvenokart, glikolizes cela
18 x zemaka ATF produkcijas efektivitate ka
oksidativas fosforilešanas gadijuma!!! Veža šunas
to var atlauties, paaugstinot glikozes
transportieru, piemeram, GLUT1 ekspresiju, kas
nodrošina pietiekamu glikozes koncentraciju
citoplazma. Funkcionala jega nav lidz galam
skaidra iespejams, glikolizes starpprodukti
nodrošina efektivakus biosintezes celus.
27
(8) Izvairišanas no imunreakcijas
Dunn GP et al, Nat Immunol, 2002
Eliminešana efektiva audzeju šunu
iznicinašana Lidzsvars imunsistemas spiediens
veicina tadu audzeja šunu selekciju, kas ir
rezistentas pret imunreakciju Izbegšana
imunologiski izselekcionetas audzeja šunas spej
augt imunokompetenta organisma
28
(9) Genetiska nestabilitate lidzeklis veža
fenotipa iegušanai
Šo fiziologisko ipašibu iegušanai ir
nepieciešamas mutacijas vairakos specifiskos
genos viena šuna. Paaugstinats mutaciju biežums
veidojas pateicoties mutacijam genos, kas sarga
genoma stabilitati. Mutacijas, kas izraisa genoma
nestabilitati ir nepieciešamas audzeja
iniciacijai un progresijai. Genetiskajai
nestabilitatei ir jabut pietiekamai, lai
nodrošinatu selekciju, bet ne parmerigai.
Selektiva barjera - piemeram, hipoksija, augšanas
faktoru nepietiekamiba
29
Genetiskas nestabilitates veidi
Mikrosatelitu nestabilitate (MIN) MIN rodas
pateicoties mutacijam DNS reparacijas (kludu
labošanas) genos un izpaužas ka paaugstinats
mutaciju biežums nukleotidu limeni (2-3 reizes
lielaks mutaciju biežums ka normalas šunas). Ši
fenotipa markieris ir mikrosatelitu garuma
atškiribas (mikrosateliti ir gari mono- vai
di-nukleotidu atkartojumi, kuros ipaši bieži
rodas mutacijas Hromosomala nestabilitate
(CIN) Epigenetiska nestabilitate
30
Genetiskas nestabilitates veidi
Mikrosatelitu nestabilitate (MIN) Hromosomala
nestabilitate (CIN) CIN raksturigas hromosomu
skaita vai strukturas izmainas, kas rodas
hromosomu segregacijas defektu rezultata mitozes
laika. Tas rodas pateicoties mutacijam genos, kas
iesaistiti G2/M kontrolpunkta, mitotiskas
varpstas veidošana, centrosomu darbiba un
hromosomu segregacija. Epigenetiska
nestabilitate
31
Genetiskas nestabilitates veidi

• Mikrosatelitu nestabilitate (MIN)
• Hromosomala nestabilitate (CIN)
• Epigenetiska nestabilitate
• Daudzos audzejos ir noverojamas dažadas
  epigenetiskas izmainas, ieskaitot DNS
  hipometilešanu, kas var but pamata proto-onkogenu
  aktivacijai vai hipermetilešanu, kas var izraisit
  tumor-supresor genu inaktivaciju. Tacu joprojam
  nav skaidrs
• Kas izraisa izmainas DNS metilešana?
• Vai tas ir atkarigas no mutacijam kada konkreta
  gena?
• Vai epigenetiskas izmainas var iniciet
  karcinogenezi?

32
(10) Hronisks iekaisums veicina audzeju attistibu
Audzejos bieži atrod infiltrejušas imunsistemas
šunas, tacu to darbiba var izraisit dažadus
efektus gan audzeja šunu iznicinašanu, gan
radit audzeju veicinošus signalus. Hronisks
iekaisums ir daudzu audzeju priekš-veža stavoklis
(piemeram, hronisks atrofisks gastrits ir kunga
veža priekš-veža stavoklis)
33
(No Transcript)
34
Audzeju celulara un genetiska heterogenitate,
mikrovide un veža cilmes šunas
35
Vezis sarežgits organs, kas sastav no daudziem
šunu tipiem, nevis homogena šunu masa
Hanahan D Weinberg RA, Cell 144, 2011
36
Veža šunu genetiskas heterogenitates veidošanas
modeli
Russnes HG et al, J Clin Invest, 2011
37
Veža cilmes šunas (Cancer stem cells (CSC),
Tumour initiating cells (TIC), Stem cell-like
cells (SCLC) Veža šunu populacija, kam piemit
cilmes šunu ipašibas (pašatjaunošanas un speja
radit daleji diferencetas meitšunas), spej
iniciet audzeja veidošanos eksperimenta
dzivniekos un ir rezistentas pret staru un
kimijterapiju
38
Veža cilmes šunu ipašibas

• Ir cilmes šunas virsmas markieri, piemeram CD133,
  CD44, ABCB5
• Eksprese cilmes šunam raksturigus transkripcijas
  faktorus un genu ekspresijas regulatorus Oct4,
  Lin28, Nanog, Sox2
• Rezistentas pret staru un kimijterapiju
• CSC biežums dažados audzejos var but dažads
  0.1-30 no visas šunu masas
• Neliels skaits (100-500) CSCs spej veidot
  audzeju imunodeficitas peles injicejot audzeju
  šunas, kamer ir vajadzigas 106 neškirotas šunas,
  lai inicietu audzeja veidošanos

39
No ka rodas veža cilmes šunas?
40

• Veža (cilmes) šunu plasticitate

• Hipoksijas atbilde
• Epiteliali-mezenhimala tranzicija
• Audzeja mikrovides ietekme
• Kimijterapijas ietekme?

41
Veža cilmes šunas ka terapeitiskais merkis
Eramo A et al, Oncogene, 2010
42
Iedzimta veža predispozicija
Audzeji attistas somatisku mutaciju
rezultata. Bet... Katra individa risku saslimt
nosaka iedzimtas mutacijas (vai polimorfismi),
kas var palielinat (vai samazinat) risku, tacu
neiedzimst pats audzejs.
43
Iedzimto veža predispozicijas sindromu pazimes

1. Gimenes vesture ar vairakiem saslimšanas
   gadijumiem pirmas un otras pakapes radiniekiem
   (kruts vezim vismaz 3)
2. Agraks saslimšanas vecums ka sporadiskajos
   gadijumos (kruts vezim pirms 46 gadu vecuma)
3. Multipli primarie audzeji (piemeram, kruts un
   olnicu Ca)
4. Bilaterali tumori

44
Veža predispozicijas geni

• Pašlaik ir zinami vairak ka 30 geni, kuru
  mutacijas (iedzimtas!) ir saistitas ar veža
  predispozicijas sindromiem
• Funkcionalas kategorijas
• Geni, kas iesaistiti šunu proliferacija,
  izdzivošanas signalos, starpšunu komunikacija
  (galvenokart, audzeju supresori)
• Genetiskas stabilitates geni
• Geni, kas saistiti ar kancerogenu vielu
  metabolismu un detoksifikaciju

45
Geni, kas izraisa veža predispozicijas sindromus
Gens Gena funkcija Audzejs
RB Šunas cikla regulacija Retinoblastoma
CDKN2A CDK inhibitors šunas cikla regulacija Melanoma
CDH Šunas šunas adhezija Difuza tipa kunga vezis
XPB, XPD DNS bojajumu labošana (NER) Bazalo šunu karcinoma
BRCA1, BRCA2 Transkripcijas regulacija, DNS reparacija Kruts un olnicu vezis
MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 DNS kludu labošana (MMR) Ne-polipozais kolrektalais un endometrija vezis
46
(No Transcript)
47
Molekularo biomarkieru pielietojums kliniskaja
prakse
Veža biomarkieris jebkura organisma atrodama
viela, kas norada uz veža klatbutni, slimibas
stadiju un gaitu vai pacienta reakciju uz zalem,
un var tikt objektivi izmerita.
48

• Biomarkierus var klasificet dažados veidos
• Diagnostika, monitorings, prognostika, terapijas
  efektivitates prognozešana utt.
• Kvantitativi (piemeram, genu ekspresijas limenis
  vai proteina koncentracija) vs diskreti/kvalitativ
  i biomarkieri (SNP, mutacijas)
• Audu biomarkieri vs seruma/organisma škidrumu
  biomarkieri

49
Diagnostikas biomarkieris jebkura molekula
(SNP, mutacija, genu ekspresijas limenis,
proteins, glikoproteins, antiviela utt), kas
kvalitativi vai kvantitativi atškiras veža audos
un normalos audos vai veža pacientu un veselu
cilveku biologiskajos škidrumos (seruma, urina,
krepas u.c.) Prognostikas biomarkieris -
korele ar slimibas gaitu/dzivildzi un liecina par
audzeja agresivitati Terapijas efektivitates
biomarkieris (predictive biomarker) korele ar
konkretas terapijas efektivitati un var tikt
izmantots arstešanas kursa izvelei konkretam
pacientam
50
Biomarkierus raksturojošie raditaji
Jutiba veža pacientu proporcija, kas tiek
noteikti ka veža pacienti (SnTP/(TPFN) Specifis
kums veselo cilveku proporcija, kas tiek
noteikti ka veseli (SpTN/(TNFP)
51
Filadelfijas (Ph) hromosoma biomarkieris
hroniskas mieloleikozes (HML) diagnostikai
Ph hromosoma sastopama gt95 HML gadijumu un
BCR-ABL hibridais proteins ir saistits ar
leikozes iniciaciju. Biomarkiera jutiba gt95,
specifiskums gt99.9, kvalitativs biomarkieris
52
BCR-ABL mRNS noteikšana ar RT-PCR
Ph hromosomas detektešanai izmanto RT-PCR, ar ka
palidzibu tiek noteikta hibridas BCR-ABL mRNS
klatbutne var detektet vienu Ph šunu starp 106
normalam šunam BCR-ABL mRNS kvantificešanu ar
reala laika RT-PCR var izmantot arstešanas
efektivitates un MRD (minimal residual disease)
monitoringam.
53
PSA (prostatas specifiskais antigens)
biomarkieris prostatas veža skriningam

• PSA serina proteaze, ko produce prostatas
  šunas
• Prostatas veža šunas PSA produkcija ir tada pati
  vai mazaka ka normalas prostatas šunas
• PSA tests nosaka PSA koncentraciju asinis
• Asinis pastiprinata daudzuma nonak, ja izmainas
  bazalas membranas un asinsvadu sieninas
  caurlaidiba tas notiek gan iekaisuma, gan veža
  gadijuma.

54
PSA priekšrocibas un trukumi
Kvantitativs biomarkieris Jutiba
72 Specifiskums 65 Specifiskums pelekaja
zona 2-4ng/ml 20
Pros Cons
Neinvazivs tests var izmantot skrininga programmas Prostatas, ne prostatas veža specifisks
Augsta jutiba Daudz kludaini pozitivu rezultatu
Neatškir agresivus no leni progresejošiem audzejiem
55
Oncotype DX tests kruts veža recidivu un
terapijas efektivitates prognozešanai

• Pielieto arstešanas taktikas izvele ER, LN-
  kruts veža pacientem.
• Balstas uz 21 gena ekspresijas analizi kruts veža
  šunas.
• Rezultats Recurrence score, kas parada
  varbutibu, ar kadu pacientei 10 gadu laika
  veidosies recidivs un prognoze hormonu terapijas
  efektivitati.
• Galvenais ieguvums saudzigaka terapija mazak
  agresivu audzeju gadijumos var atlasit
  pacientes, kam pietiek ar tamoksifenu un var
  iztikt bez kimijterapijas

Nesen iznacis Oncotype DX tests II stadijas
resnas zarnas veža prognostikai
56
Companion diagnostics molekularo biomarkieru
testi konkretu zalu efektivitates prognozešanai

• Piemeram, Her2/neu gena amplifikacija
  Herceptins EGFR ekspresija Cetuximab c-Kit
  IHC Gleevec (GIST audzeji)
• Parasti šie testi tiek izstradati partneriba ar
  zalu ražotaju
• Viens no straujak augošiem tirgiem pasaule

• EGF (Epidermala augšanas faktora) signalcelš var
  tik aktivets KRAS mutaciju vai EGFR
  amplifikacijas rezultata
• EGFR inhibitori ir efektivi, ja nav KRAS
  mutacijas un ir EGFR amplifikacija

http//www.fda.gov/MedicalDevices/ProductsandMedic
alProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm