PH

1
PHÂN IIIMÔ?T SÔ UNG DU?NG CHU? YÊU CU?A CÔNG
NGH? GEN

• CHUONG VIII
• UNG DU?NG KY CÔNG NGH? GEN TRONG Y HO?C VA
  CHÂ?N ÐOAN

2
I. Ky thuâ?t gen trong sa?n xuât chê phâ?m
sinh ho?c

• Sa?n xuât insulin tai tô? ho?p
• 1.1 Luo?c su? nghiên cuu insulin
• Do cac tê bao beta cu?a tuyên tu?y sa?n
  xuât, dong vai tro chuyê?n hoa duong
• Bê?nh tiê?u duong (Diabetes) do thiêu hu?t
  insulin.
• Tu nam 1922 da tach chiêt insulin tu tu?y
  bo va lo?n dê? diêu tri? tiê?u duong

3

• Câu truc phân tu? insulin nguoi duo?c phat
  hiê?n vào nam 1926. Nam 1955 Sanger va cô?ng su?
  da gia?i trinh tu? va sap xêp acid amin
• 1963-1965 da tô?ng ho?p nhân ta?o bang con
  duong hoa ho?c ? dat, không phu ho?p
• 1967, phat hiê?n câu truc proinsulin
• 1969, phat hiê?n 3 da?ng câu truc
• 1978, sa?n xuât insulin tai tô? ho?p trong
  E.coli
• 1982, insulin duo?c phep luu hanh o? châu Â?u.
  Ban o? My nam 1983

4
(No Transcript)
5
1.2 C?u trúc gen mã hóa insulin ? ngu?i

• Gen mã hóa insulin (IND) n?m trên NST s? 11, trên
  cánh ng?n (11p)
• Vùng không mã hóa chia làm 3 c?m gen ký hi?u I,
  II và III
• Vùng mã hóa có kích thu?c 1430 bp. Trong vùng mã
  có 2 intron.
• Ðo?n gen mã hóa cho 4 peptid c?a phân t? insulin
  Chu?i peptid tín hi?u (leader), chu?i B, chu?i C
  và chu?i A

6
Preproinsulin is difficult for E.coli to produce
Contains a signal sequence A,B, C sections of
protein Signal sequence is removed after
targeting to RER Translation continues on RER
(forming proinsulin) Removal of 33 amino acids
at Golgi and S-S joining of A and B chains to
form insulin
7
Insulin
Insulin is made up of 2 chains 51 amino acids
total A chain 21 amino acids B chain 30 amino
acids
8
In reality both chains are present in the same
protein
9
1.3 Công ngh? s?n xu?t insulin tái t? h?p

• Nguyên lý chung bao g?m
• Tách chi?t và tính s?ch RNA thông tin mã hoá
  preproinsulin
• Th?c hi?n k? thu?t phiên mã ngu?c
• S? d?ng enzym gi?i h?n lo?i b? gen mã hóa chu?i
  C, tách dòng riêng t?ng do?n gen mã hóa chu?i A
  và B
• T?o vector bi?u hi?n gen do?n A và B

10

• - Bi?n n?p riêng m?i lo?i vector trong E.coli
• Th?c hi?n quá trình lên men thu protein chu?i
  A-lacZ và B-lacZ
• Thu riêng t?ng lo?i protein lai và th?c hi?n ph?n
  ?ng c?t v?i cyanur bromid gi?a a.a cu?i cùng c?a
  insulin và a.a c?a ?-galactosidase
• Tách và tinh s?ch chu?i A và B, sau dó t?o h?n
  h?p chu?i A và B, hình thành c?u n?i disulfit và
  thu insulin thành ph?m

11
S?n xu?t insulin tái t? h?p
12
Human Insulin Production by Bacteria
13
Human Insulin Production by Bacteria
Screening bacterial cells to learn which contain
the human insulin gene is the hard part.
14
Route to the Production by Bacteria of Human
Insulin
This is the step when gene cloning takes place.
The single recombinant plasmid replicates within
a cell.
Then the single cell with many recombinant
plasmids produces trillions of like cells with
recombinant plasmid and the human insulin gene.
15
Route to the Production by Bacteria of Human
Insulin
The final steps are to collect the bacteria,
break open the cells, and purify the insulin
protein expressed from the recombinant human
insulin gene.
16
Route to the Production by Bacteria of Human
Insulin
Overview of gene cloning.
Cloning animation
17
2. S?n xu?t hormon sinh tru?ng tái t? h?p

• 2.1 L?ch s? nghiên c?u hormon sinh tru?ng
• Hormon sinh tru?ng ngu?i (hGH Human Growth
  Hormone) phát hi?n nam 1920. Nam 1950 dã tách
  chi?t hGH t? tuy?n yên ngu?i.
• 1956, hGH tách t? não bò, c?u, dùng d? ch?a
  b?nh lùn ? tr? em.
• 1972, c?u trúc phân t? c?a hGH du?c xác d?nh
• 1985, hãng Genetech s?n xu?t thành công hGH có
  tên Protropin.

18

• Hormon sinh tru?ng ngu?i hi?n nay ch? y?u s?n
  xu?t b?ng phuong pháp tái t? h?p gen. Có nhi?u
  s?n ph?m thuong m?i giúp di?u tr? b?nh hay giúp
  cho phát tri?n co b?p.
• hGH là protein nh?, có 191 a.a. Trong phân t? có
  2 liên k?t disulfit
• Các gen mã hóa hGH c?a ngu?i, bò chuy?n vào d?ng
  v?t nhu cá, l?n,t?o d?ng v?t chuy?n gen phát
  tri?n nhanh.

19
Human Growth Hormone (HGH) (somatotropin)

• HGH promotes overall body growth
• by increasing amino acid uptake by cells, protein
  synthesis and fat utilization for energy
• Insufficient production of HGH by the pituitary
  gland dwarfism
• Chubby face
• Baby fat around waist
• Unusual body properties as an adult
• 4 feet tall only
• IQ Normal
• HGH helps undersized children reach their normal
  height and size

http//www.hopkinsmedicine.org/hmn/F01/photos/36.j
pg
20
2.2 C?u trúc gen mã hóa hormon sinh tru?ng ngu?i

• H? gen có 5 gen mã hóa, n?m trên cánh dài NST th?
  17, kích thu?c 66 kb
• Gen mã hóa hGH b? d?t bi?n ho?c r?i lo?n, d?n d?n
  thi?u h?t hormon sinh tru?ng, gây h?i ch?ng lùn
  b?m sinh
• Gen hGH có do?n trình t? mã hóa chu?i peptid tín
  hi?u không tuong thích promoter c?a E.coli, do dó
  bi?u hi?n gen hGH tái t? h?p trong E.coli r?t y?u
  ho?c không ho?t d?ng

21
2.3 Công ngh? s?n xu?t hormon sinh tru?ng ngu?i
TTH

• Bao g?m các bu?c
• Tách chi?t và tinh s?ch mRNA t? t? bào thùy tru?c
  tuy?n yên và th?c hi?n k? thu?t phiên mã ngu?c
• S? d?ng enzym gi?i h?n c?t b? do?n gen mã hóa
  23-24 a.a c?a chu?i peptid tín hi?u
• Chuy?n gen mã hóa hGH vào vector bi?u hi?n thích
  h?p
• Bi?n n?p vector TTH vào E.coli, nuôi c?y, thu
  sinh kh?i, tách chi?t và tinh s?ch hGH
• T? bào bi?u hi?n vi khu?n, baculovirus, n?m men,
  t? bào tr?ng chu?t

22
Pressure to use HGH to stimulate growth in
youngsters who have no deficiency but whose
parents want them to grow up tall.

• In the summer of 2003, the U.S. FDA approved the
  use of human growth hormone (HGH) for
• boys predicted to grow no taller than 5'3? and
• for girls, 4'11?
• even though otherwise perfectly healthy.

If adult suffers with hypopituitarism, HGH
therapy is also available as normally payable
under an insurance policy.
23
Pre-recombinant era of HGH production
HGH could be purified from cadaver (t? thi)
pituitary glands
8 cadavers/year for 8 10 years per patient
Creutzfeldt-Jacob Disease (CJD) is one of the
risk of using brain tissue
24 cases reported by 1993 in France from cadaver
HGH
24
Protropin (Genentech) and Humatrope (Eli Lilly)
hGH therapy is very expensive, costing anywhere
from 800 to 2,500 a month
Native human GH contains signal peptide needed
to direct nascent polypeptide to RER in
eukaryotes Signal peptide is bad for E.coli (it
can not synthetize this protein) Signal sequence
removed be EcoRI cleavage Coding sequence for
first 24 aa also lost in the process of
removal 24 amino acids added back by synthetic
DNA linker Expressed in E. coli successfully
25
3. S?n xu?t interferon tái t? h?p

• 3.1 Lu?c s? nghiên c?u interferon
• - Nam 1930, phát hi?n gia súc nhi?m b?nh do m?t
  lo?i virus này, ít b? nhi?m lo?i virus khác.
  Isaacs và Linderman (1957) khi nuôi c?y phôi gà
  dã phát hi?n 1 lo?i protein m?i gây ?c ch? tái
  b?n virus, g?i là interferon (IFN)
• - Tru?c nam 1980, s?n xu?t IFN t? t? bào b?ch c?u
  ngu?i, lây nhi?m virus, sau dó nuôi trong phôi gà
  d? t? bào b?ch c?u sinh IFN ? Giá thành d?t

26

• Tháng 1 nam 1980 thành công s?n xu?t IFN b?ng con
  du?ng TTH trong E.coli
• Interferon là protein ho?c glycoprotein, TLPT
  16-45 kDa. Có tác d?ng ngan c?n s? xâm nhi?m c?a
  virus ho?c kìm hãm phát tri?n kh?i u.
• Interferon chia làm 2 nhóm
• Nhóm 1 IFN a, IFN ß, IFN ?
• Nhóm 2 IFN ? kém b?n trong acid

27
Interferons are small proteins released by
macrophages, lymphocytes, and tissue cells
infected with a virus. When a tissue cell is
infected by a virus, it releases interferon.
Interferon will diffuse to the surrounding cells.
When it binds to receptors on the surface of
those adjacent cells, they begin the production
of a protein that prevents the synthesis of viral
proteins. This prevents the spread of the virus
throughout the body.
General Action of
Interferons

• Three types of interferons alpha, beta and
  gamma.

28
Type I Interferons

• Type I alpha and beta
• Alpha interferons are produced by leukocytes
• Beta interferons are produced by fibroblasts
• Both bind to interferon cell receptors type 1
  and both encoded on chromosome 9
• They have different binding affinities but
  similar biological effects
• Viral infection is the stimulus for alpha and
  beta expression
• Used to mobilize our 1st line of defense against
  invading organisms
• Largest group and are secreted by almost all
  cell types

29
Type II Interferon (gamma)

• Bind to type 2 receptors and its genes are
  encoded on chromosome 12
• Initially believed that T helper cell type 1
  lymphocytes, cytotoxic lymphocytes and natural
  killer cells only produced IFNg, now evidence
  that B cells, natural killer T cells and
  professional antigen-presenting

• cells secrete IFNg also.
• Gamma production follows activation with immune
  and inflammatory stimuli rather than viral
  infection.
• This production is controlled by cytokines
  secreted by interleukin 12 and 18.

30
IFN tái t? h?p

• Interferons are broken down into recombinant
  versions of a specific interferon subtype and
  purified blends of natural human interferon.
• Many of these are in clinical use and are given
  intramuscularly or subcutaneously
• Recombinant forms of alpha interferon include
• Alpha-2a drug name Roferon
• Alpha-2b drug name Intron A
• Alpha-n1 drug name Wellferon
• Alpha-n3 drug name AlferonN
• Alpha-con1 drug name Infergen

• Recombinant forms of beta interferon include
• Beta-1a drug name Avonex
• Beta-1b drug name Betaseron

• Recombinant forms of gamma interferon include
• Gamma-1b drug name Acimmune

31
How Does It Prevent Viral Replication?
virus
cells
(Other stimuli exogenous ds RNA, LPS, bacterial
components)
32
How Does It Prevent Viral Replication?
virus
interferon
33
How Does it Prevent Viral Replication?
No replication
virus
Inhibitory proteins
34
3.2 Gen mã hóa ? ngu?i và co ch? sinh IFN

• Trong t? bào ngu?i IFN-a mã hóa b?i 22 gen n?m
  trên cánh ng?n c?a NST s? 9, gen mã hoá IFN-ß n?m
  trên NST s? 2
• Gen mã hóa IFN-? n?m trên NST s? 12, g?m 4 exon.
  S?n xu?t trong t? bào lympho T

35
Vai trò c?a IFN trong tr? b?nh do nhi?m virus

• Ði?u tr? viêm gan và ?ng d?ng trong di?u tr? ung
  thu

36
Tuberculosis susceptibility genes
VDR
Y
IFNg
P2X7
IFNgR1
Y
IFNgR2
STAT1
NRAMP1
iNOS
IL-12Rb2
IL-12Rb1
HLA-DR2
IL-1b TNF IL-10
MBL
T cell/NK cell
Infected Macrophage
Shown to be linked or associated with TB in more
than one population Conflicting studies both ve
and ve associations with TB reported Single
study shows association with TB Negative studies
not shown mostly not published!
37
3.3 Công ngh? s?n xu?t interferon tái t? h?p

• S?n xu?t IFN-a gây nhi?m nhân t?o virus vào t?
  bào b?ch c?u. S? d?ng m?t s? lo?i virus nhu
  Sendal, Newcastle, ?
• S?n xu?t IFN-ß t? nguyên bào s?i

38
4. S?n xu?t y?u y?u t? VIII và IX tái t? h?p

• Các ch?t có ?nh hu?ng d?n s? dông máu t? I d?n
  XII. Trong dó y?u t? VIII và IX dóng vai trò quan
  tr?ng.

39
5. S?n xu?t vaccin tái t?i h?p và vaccin DNA

• 5.1 Lu?c s? nghiên c?u và ?ng d?ng
• Nam 1780 Edward Jenner phát hi?n phuong pháp
  phòng b?nh d?u mùa b?ng ch?ng d?u v?i virus gây
  b?nh d?u bò gi?m d?c l?c
• Luis Pasteur phát minh vaccin ch?a b?nh d?i
• Có th? chia vaccin làm 2 nhóm truy?n th?ng và
  tái t? h?p

?
40
Smallpox - d?u mùa
41
Smallpox
42

• Vaccin truy?n th?ng là vi khu?n ho?c virus s?ng
  dã làm gi?m d?c l?c. Nhu?c di?m th?i gian b?o
  qu?n ng?n, khó b?o d?m an toàn ? tính d?c h?i l?i
• Vaccin TTH protein kháng nguyên nh? k? thu?t
  DNA. Uu di?m giá thành r?, s? d?ng r?ng rãi
  ch?ng các b?nh do vi khu?n, ký sinh trùng, viêm
  gan do virus
• Vaccin DNA có hi?u qu? cao trong phòng ch?ng b?nh
  hi?m nghèo (ung thu, AIDS,)

43
5.2 Vaccin tái t? h?p

• 5.2.1 Vaccin TTH phòng ch?ng viêm gan
• Kháng nguyên b? m?t virus viêm gan B (HBV) du?c
  s?n xu?t trong n?m men S.cerevisae t? nam 1981.
  B?t d?u s? d?ng t? nam 1986
• M?t s? s?n ph?m vaccin phòng ch?ng HBV
  Recombivax HB, Engeris B, Genhevac B, du?c s?n
  xu?t trong t? bào n?m men và vi khu?n

44
The growth cycle of Hepatitis B virusChu trình
sinh tru?ng c?a HBV
From Murray et. al., Medical Microbiology 5th
edition, 2005, Chapter 66, published by Mosby
Philadelphia,,
Figure 66-5
45

• HBV vaccin s? d?ng gen mã hóa protein v?. Protein
  kháng nguyên HBsAg có kh? nang t?o kháng th? mi?n
  d?ch m?nh nh?t.
• Gen mã hóa protein v? g?m 3 gen Pre-S1mã hóa
  chu?i peptid g?m 128 a.a, Pre-S2 mã peptid có 55
  a.a và gen S mã hóa chu?i peptid có 226 a.a
• Ngu?i ta tách riêng ho?c t? h?p S, Pre-S1 và
  Pre-S2 d? t?o t? h?p vaccin khác nhau
• Vi?t Nam là nu?c có t? l? nhi?m HBV ? m?c cao,
  viêm gan c?p tính 37-49 , xo gan có HBV 47-87 ,
  ung thu gan có HBV 57-80

46
Transcription of Hepatitis B virus
Note HBeAg (E) is encoded in C region using
different start codons and is not shown
From Murray et. al., Medical Microbiology 5th
edition, 2005, Chapter 66, published by Mosby
Philadelphia,,
Figure 66-6
47
New Methods
48
5.2.2 Vaccin tái t? h?p ch?ng b?nh s?t rét

• 300-500 nhi?m b?nh hàng nam, t? vong 1-3 tri?u
  ngu?i. Kí sinh trùng do 4 loài có vòng d?i và quá
  trình lây nhi?m ph?c t?p
• Vaccin t? gen kháng nguyên Pfs-25 dang du?c th?
  nghi?m. Gen Pfs-25 du?c tách dòng t? Plasmodium
  falciparum mã hóa cho protein có TLPT 25 kDa
• Ðã s? d?ng vaccin phòng ch?ng viêm não, cúm gà.
  Ðang phát tri?n vaccin phòng ch?ng s?t xu?t
  huy?t, HIV/AIDS

49
5.3 Vaccin DNA

• 5.3.1 Lu?c s? nghiên c?u và vai trò c?a vaccin
  DNA
• 1990 Wolff và cs th? nghi?m g?n m?t do?n DNA vào
  vector bi?u hi?n, sau dó dua tr?c ti?p vào t? bào
  s?ng ? M? ra tri?n v?ng m?i phòng ch?ng b?nh
  truy?n nhi?m
• B?nh Gumboro do virus gây b?nh trên gà. Nam 1996
  nhi?u nghiên c?u TTH gen kháng nguyên VP2 ho?c
  do?n gen VP3, VP4 t?o vaccin DNA.

50

• Vaccin DNA g?m 2 lo?i vaccin t?p h?p gen kháng
  nguyên và vaccin t?p h?p gen sinh kháng th?
• Vaccin có nhi?u uu di?m d? dàng thi?t k?, s?n
  xu?t, b?o qu?n

51
DNA Vaccines and HIV

• HIV could be prevented using DNA Vaccines
• -By isolating the gene for a protein produced by
  HIV, a DNA Vaccine could be created and immunity
  for the protein and thus HIV could be
  established. People would then be able to be
  immune to HIV.
• Many experiments have been done
• -Researchers have attempted to create many
  varying DNA Vaccines, but none have been entirely
  successful in humans.
• Envelope gene
• -A specific gene of HIV that could be used to
  create a DNA Vaccine for HIV.

www.wellesley.edu
4
52
II. S? d?ng k? thu?t gen trong ch?n doán và di?u
tr?

• S? d?ng k? thu?t gen trong ch?n doán và di?u tr?
  ung thu do virus
• - Ung thu vòm h?ng do virus RBV (Epstein-Barr
  virus)
• - Phát hi?n 6 lo?i virus gây viêm gan nguyên phát
  (HAV, HBV, HCV, HDBV, HEV và HGV)

53
1.2 K? thu?t gen và ?ng d?ng trong di?u tr? ung
thu

• Phuong pháp ph? bi?n di?u tr? ung thu dùng vector
  li?u pháp gen t? Paramyxovirus và k?t h?p x? tr?
• Hon 50 tru?ng h?p ung thu ? ngu?i liên quan d?n
  ho?t tính gen p53
• Gen p53 có kích thu?c 23 kb, n?m trên NST 17.
• Gen p53 s?n xu?t protein có TLPT 53 kDa, di?u hòa
  quá trình phân chia t? bào và kích ho?t hi?n
  tu?ng ch?t theo chu trình (apoptosis)

54
Gene Therapy Principles
AAV
Nucleus
Adenovirus
Therapeutic Protein
Retrovirus/Lentivirus
Target Cell
Naked DNA
55
2. Ch?n doán m?t s? b?nh nhi?m trùng b?ng PCR

• Ch?n doán s?m ký sinh trùng s?t rét Plasmodium
  falciparum, P. vivax, P. ovale và P.malariae.
• Ch?n doán nhi?m vi khu?n lao Mycobacteria
  tuberculosis
• Ch?n doán virus Dengue gây s?t xu?t huy?t

56
4. S? d?ng k? thu?t microarray trong ch?n doán
b?nh

• M?ng (th?y tinh, nh?a) có kích thu?c nh? ch?a m?u
  dò (300 ngàn hàng tri?u) cho phép ch?n doán
  nhanh các b?nh liên quan v?t ch?t di truy?n (DNA,
  RNA)

57
Experimental approaches
DNA microarray
Principle
Application to signaling Fibroblasts stimulated w
ith serum 8600 genes.
58
5. S? d?ng k? thu?t gen trong ch?n doán b?nh
nhi?m trùng ? v?t nuôi

• Ch?n doán m?t s? b?nh thu?ng g?p trên tôm b?nh
  d?m tr?ng do WSSV, còi do MBV, d?u vàng (YHV)

59
The Asian pandemic WSSV
60
6. S? d?ng k? thu?t gen trong ch?n doán b?nh cây
tr?ng và th?c ph?m chuy?n gen

• B?nh héo xanh do Xanthomonas
• Phát hi?n b?p, ngô chuy?n gen