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ADN recombinante
Dr. Luis A. Mora B. Cátedra de Bioquímica UCIMED
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IMPORTANCIA BIOMÉDICA

• Diagnóstico
• Medicina forense
• Terapia génica
• Producción de medicamentos
• insulina
• factores de la coagulación
• activador del plasminógeno
• hormona de crecimiento
• Producción de vacunas
• Antihepatitis B

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IMPORTANCIA BIOMÉDICA

• Diagnóstico de enfermedades genéticas con cambios
  en la secuencia de ADN.
• Identificación de las bases moleculares de la
  enfermedad
• Hipercolesterolemia Familiar
• Drepanocitosis
• Talasemias
• Fibrosis Quística
• Distrofia Muscular

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ESTRUCTURA MOLECULAR DEL ADN

• Forma
• Componentes
• Apareamiento de las bases
• Pares de bases en genoma haploide humano. 3x109
• Longitud de genes. 3x103
• Empacamiento del ADN

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(No Transcript)
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EXPRESIÓN GENÉTICA DEL ADN

• Replicación
• Transcripción (Exones e intrones)
• Traducción
• Síntesis de proteínas

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(No Transcript)
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(No Transcript)
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TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

• Aislamiento del ADN
• Desnaturalización
• Manipulación
• Endonucleasas
• Polimerasas
• Formación de moléculas quiméricas

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TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

• También conocidas como endonucleasas, son enzimas
  que cortan los enlaces fosfodiéster del material
  genético a partir de una secuencia de nucleótidos
  que reconocen (diana de restricción ) estos
  tienen entre 4 y 12 pb.
• Arber, Nathans y Smith, 1978, Nobel de Medicina.
  E. coli. Insulina humana.
• Las mismas permiten cortar ADN de hebra doble,
  donde reconocen secuencias palindrómicas (se leen
  igual en ambas direcciones). Esto produce dos
  extremos romos y cohesivos o escalonados. Estos
  pueden unirse por ligasas.
• ADN vector capaz de replicarse
  independientemente del de la célula anfitriona
  plásmidos.
•  De organismos procarióticos (bacterias), donde
  actúan como un mecanismo de defensa, para
  degradar material genético extraño. Las bacterias
  tienen la capacidad de metilar su ADN, lo cual
  sirve para distinguir entre el ADN extraño y el
  ADN propio. No pueden cortar ADN metilado.
• Isoesquizómeros distintas, de diferentes
  especies, idéntica diana , dejan el mismo extremo
  cohesivo pero no cortan en el mismo sitio.

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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
  Tipo 1 Restricción (cortan) y modificación
(metilan).Al reconocer cortan al azar en sitios
distintos , ya sea corriente arriba o abajo,
dejan extremos cohesivos. Necesitan ATP para
moverse a través de la molécula de DNA, desde el
lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte
(unas 1000 pb), S adenosil metionina (SAM) y Mg
2 como cofactores.  Tipo 2 Sólo restricción.
Otras enzimas metilan. Cortan de manera
consistente y predecible en el sitio que
reconocen o muy cerca de él. Por ello son muy
utilizadas en clonación, pues se pueden recuperar
secuencias conocidas. Sólo requieren Mg como
cofactor.  No necesitan ATP. Tipo 3 Restricción
y modificación. Se utiliza una enzima oligomérica
que realiza todas las actividades. Cortan de 25 a
27 pb lejos del sitio restrictivo, dejando
extremos cohesivos. Requieren dos secuencias de
reconocimiento de orientación opuesta en la misma
cadena de ADN. Necesitan ATP, Mg y SAM.
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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Nomenclatura  Se asigna según el origen
bacteriano. Consiste en 1)Tres letras que
corresponden al nombre científico del
microorganismo Escherichia coli (Eco) 2)
La cepa o estirpe si la hubiere. ( EcoR, aislada
de la cepa RY13 de E. coli ) 3) En números
romanos para distinguir si hay más de una
endonucleasa aislada de una misma especie. No
confundir con el tipo o clase de enzima. 4)
Todas deberían llevar delante una R de
restricción o M de metilasa según la función pero
usualmente se omite.
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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Las enzimas de restricción al cortar el DNA
pueden producir 2 tipos de cortes   1.
Cohesivos o pegajosos     GAATTC
GGATCC AAGCTT
CTTAAG CCTAGG
AACGAA EcoRI
BamHI
HindIII 2.  Abruptos   AATATT
CCCGGG
TTATAA GGGCCC  
SspI SmaI
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TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

• Definición
• Vectores
• Plásmidos
• bacterianos
• ADN circular de doble banda
• Inserción de 6-10 Kb
• Fagos
• virales
• ADN lineal de doble banda
• inserción de 10-20 Kb
• Cósmidos
• Son plásmidos con características de fagos
• ADN circular de doble banda
• inserción de 35-60 Kb
• YAC
• Son cromosomas artificiales de levaduras

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TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

• Propiedades de los vectores
• Replicaciones independientes del ADN de la
  célula hospedera
• Secuencias de ADN conocidas
• Copias únicas
• Cromosoma más pequeño que el del hospedero

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TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
18
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
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(No Transcript)
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CLONACIÓN

• Definición
• m. Biol. Conjunto de células u organismos
  genéticamente idénticos, originado por
  reproducción asexual a partir de una única célula
  u organismo o por división artificial de estados
  embrionarios iniciales.
• m. Biol. Conjunto de fragmentos idénticos de
  ácido desoxirribonucleico obtenidos a partir de
  una misma secuencia original.

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CLONACIÓN
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Gracias