Pr

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Préparation des échantillons

• ABC/BVC
• Mai 2002 Montgodinne
• N.Schaaf-Lafontaine
• Laboratoire dHématologie CHU ULg

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Cellules et Flux

• Le cytomètre de flux analyse la fluorescence et
  la lumière diffusée de cellules en suspension.
• Si les cellules sont en suspension dans
  léchantillon (cultures, sang), la préparation
  et lanalyse sont directes tandis que dans le cas
  de tissus solides, il faut une étape
  supplémentaire de dissociation .
• Le volume de suspension cellulaire requis est
  habituellement 0.5 ml et la concentration idéale
  105 à 106 cellules /ml.
• La suspension cellulaire ne doit pas contenir de
  débris cellulaires ni daggrégats afin de réduire
  les risques dobstruction des tubulures.
• Lorsque lexpression de la molécule recherchée
  est à la fois intracellulaire et membranaire, il
  faut sassurer de la localisation détectée.

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Fluorochromes

• Les anticorps monoclonaux et polyclonaux
  (préparations purifiées ou fractions Fab2 de
  préférence) sont couplés à lisothiocyanate de
  fluorescéine (FITC) le plus souvent.
• Pour la réalisation de marquages multiples, on
  utilise simultanément des anticorps monoclonaux
  couplés chacun à un fluorochrome différent.
• Avec un laser argon 488 nm, les combinaisons les
  plus courantes sont FITC/PE
• FITC/IP
• FITC/PE/PerCP
• FITC/RD1/ECD/PC5..
• Avec 2 lasers (Argon 488nm et HeNe 633 nm)
• FITC/PE/APC
• FITC/PE/ECD/APC

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Méthode directe / Méthode indirecte

• Il est possible de conjuguer (covalence) des
  protéines et dautres molécules à des colorants
  fluorescents tout en préservant leur activité
  biologique. De tels conjugués peuvent ensuite
  être utilisés pour la détection des molécules
  auxquelles ils se lient.
• Certaines de ces molécules fluorescentes ont la
  propriété de se lier directement à des éléments
  cellulaires (par ex. Ac.nucl.).
• Il est possible de coupler ces fluorochromes à
  des anticorps monoclonaux ou polyclonaux sans
  perte de spécificité lors de la liaison à
  lantigène.

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Titration des réactifs anticorps

• Il est recommandé de titrer les préparations
  danticorps utilisés (commerciales ou non) sur
  les populations cellulaires dintérêt.
• Cette titration est réalisée par dilutions
  successives du réactif pour un nombre standard de
  cellules ( 106 dans 100 µl pour chaque dilution).
  Le même volume de réactif étant utilisé pour
  chaque point.
• Pour une manipulation comprenant lavage suivi de
  fixation, la dilution précédant lintensité
  maximale est choisie.

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Immunomarquage (1)

• Les Anticorps sont généralement conservés en
  solution en présence dazide
• Les anticorps non couplés sont très stables et
  leur réactivité peut se maintenir pendant des
  années à condition de ne pas subir de fréquents
  cycles de congélation-décongélation.
• Les Anticorps couplés à un fluorochrome sont
  beaucoup moins stables et seront conservés à 4C,
  dans lobscurité et en présence dazide.
• Les Anticorps monoclonaux qui reconnaissent un
  même antigène, à moins dappartenir à un même
  clone, peuvent différer en spécificité dépitope,
  avidité, isotype et réaction croisée.
• Le marquage aspécifique de bruit de fond et les
  réactions croisées sont plus faibles après
  marquage par Anticorps monoclonaux (versus
  polyclonaux).
• Toutes les réactions Anticorps-Antigène sont
  réversibles. Les cellules colorées seront
  maintenues à 4C. Lanalyse de fluorescence après
  immunomarquage se fait dautant plus rapidement
  que les cellules ne sont pas fixées.

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Immunomarquage (2)

• Les anticorps vont se lier aux cellules
  non seulement par une réaction spécifique
• paratope-épitope mais aussi, avec une
  affinité plus faible cependant, par une
• réaction aspécifique à dautres
  éléments cellulaires.
• Les récepteurs pour le fragment Fc des
  Igs exprimés à la surface de certaines
• cellules sont en partie responsables de
  ce type de liaison. Le choix des réactifs
  
• dimmunomarquage, la classe ou
  sous-classe des anticorps, sera adapté aux
  propriétés
• des cellules étudiées. Les réactifs IgM
  génèrent fréquemment ce type de réaction
• aspécifique.
• Cette liaison est dautant plus
  importante que le réactif contient des aggrégats
  dIgs.
• Ceux-ci seront en partie éliminés par
  une courte ultracentrifugation.
• La liaison aspécifique sera réduite si
  les cellules lavées ou isolées sont prétraitées
  par
• des Igs normales non couplées ou par du
  sérum de même origine (espèce) que les
• anticorps  réactifs .
• -10 µg dIgs contrôles purifiées de même
  origine pour 106 cellules 10 min. à 4C
• - 2-5 de sérum inactivé avant
  laddition du réactif dimmunomarquage
• - utilisation de BSA (0.5 à 10) ou de
  SVF dans le milieu de lavage et dincubation
• des cellules.

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FIXATEUR

• PARAFORMALDEHYDE
• Forme polymérisée de Formaldéhyde, solide à T
  ambiante mais se dissout
• lentement en solution aqueuse en chauffant à
  60C pendant 1heure ou plus
• Sous hotte (Toxicité)
• Une polymérisation survient progressivement en
  solution aqueuse
  il faut préparer
  régulièrement (7 jours) une solution fraîche
• Formaldéhyde ne convient pas à lexception du
  réactif  microscopie électronique 
• Les solutions de fixation pour cytométrie
  proposées par les firmes conviennent
• La fixation - modifie le plus souvent
  lantigénécité des protéines de surface
• 
  des protéines
  cytoplasmiques
• - ne modifie pas la
  portion carbohydrates des gps
• - de préférence à T
  ambiante et en absence de protéines
  extracell.(sérum par ex.)
• - augmente
  lautofluorescence des cellules
• La fixation perméabilise les cellules
• 
  concentration faible de petites molécules
  pénètrent
• 
  concentration forte des molécules danticorps
  peuvent pénétrer
• Après immunomarquage des cellules, la
  conservation de fluorescence est possible.
  Lexcès de protéines est éliminé par
  lavages et le stockage a lieu dans une solution
  1 de paraformaldéhyde en PBS
  

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Prélèvement de Sang périphérique

• Cet échantillon est hétérogène du point de vue de
  la cellularité et sera manipulé différemment
  selon la population dintérêt. Les cytomètres ont
  la propriété de distinguer ces populations en
  fonction de leurs caractéristiques de diffusion
  de la lumière.
• Le sang est prélevé dans un tube contenant un
  anti-coagulant. Les caractéristiques
  morphologiques et de diffusion de lumière des
  cellules seront mieux préservées en présence
  dHéparine. LEDTA réduit le Ca2 libre et peut
  altérer lanalyse des fonctions dépendantes de
  Ca2.
• Le prélèvement est immédiatement homogénéisé avec
  lanicoagulant par retournements lents. Les tubes
  en polypropylène, comparés au verre et au
  polystyrène, ont la propriété doffrir des
  conditions minimales dadhérence et dactivation
  des plaquettes et des éléments myéloides.
• Les échantillons ne doivent pas être refroidis
  mais maintenus à 20C environ.
• Limmunomarquage sera réalisé le plus rapidement
  possible sur un échantillon ne contenant pas de
  traces de coagulation.
• Les plaquettes activées peuvent former des
  aggrégats importants qui interfèrent avec
  lanalyse des leucocytes.

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Immunophénotypage des Leucocytes
du sang

• Les érythrocytes non-nucléés constituent la
  population majeure dans le sang et leur grand
  nombre va réduire la vitesse danalyse des
  leucocytes.
• Pour cette raison, les leucocytes peuvent être
  isolés
• - par
  centrifugation sur gradient de densité.
• - par lyse des
  érythrocytes
• Les érythrocytes nucléés présents dans le sang
  des jeunes enfants et dans les prélèvements de
  moelle osseuse sont résistants à la lyse et ont
  des propriétés FSC/SSC proches de celles des
  lymphocytes.
• Il est possible de distinguer ces 2
  populations en utilisant un marquage
• - anti-CD45
  (Gp présente sur les leucocytes et non
  sur les plaquettes
  et les érythrocytes)
• -
  anti-Glycophorin A (erythr/lympho-)

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Prélèvement de moelle osseuse

• Le prélèvement se fait en présence
  danticoagulant et les échantillons sont
  conservés à 20C et traités le plus rapidement
  possible.La cellularité est hétérogène. Des
  érythrocytes nucléés ou non sont présents et
  seront éliminés (cfr sang) si le but de lanalyse
  est limmunophénotypage des leucocytes.
• Le prélèvement peut contenir une certaine
  quantité de sang il ne sera pas possible
  didentifier les origines respectives des
  cellules analysées.
  
  Il est utile de se référer aux prélèvements
  prévus pour lanalyse cytologique.
• Les analyses les plus fréquentes sont
• -immunophénotypage des leucocytes
• - évaluation des cellules CD34
• - index ADN

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Lyse des Erythrocytes

• Lapplication, aux prélèvements de sang et de
  moelle osseuse, des techniques de lyse des
  hématies permet lanalyse des leucocytes des
  échantillons non séparés sur gradient de densité.
• Différentes méthodes sont proposées dans la
  littérature H2O, solution de NH4Cl, Saponine.
• De nombreuses solutions commerciales sont
  proposées.
• La prudence simpose dans le choix de la méthode
  et la technique sera soigneusement validée pour
  chaque application. Certaines cellules nucléées
  ne conservent pas toutes leurs propriétés au
  cours de ces manipulations.
• Les solutions commerciales contiennent parfois
  des éléments fixateurs dans ce cas, lincubation
  des cellules avec les réactifs dimmunophénotypage
  doit seffectuer avant létape de lyse.
• Dans tous les cas, ces solutions seront
  conservées soigneusement et très régulièrement
  préparées (quelques jours !!!) et utilisées à T
  ambiante.

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Suspensions cellulaires réalisées à partir
de tissus solides ou de cultures

• Par traitements enzymatiques Trypsine
• 
  Collagénase
• 
  Dispase
• Par moyens mécaniques ciseaux
• 
  petit scalpel
  potter en
  verre
• 
  tamis métallique.
• Des agents chélatants (EDTA ou Citrate) sont
  utilisés avec la Trypsine par ex ce qui empêche
  Ca2 et Mg2 de maintenir la stabilité de la
  matrice. Seuls, ces agents ne peuvent libérer les
  cellules. Lactivité collagénase requiert la
  présence de Ca2, il ne faut donc pas introduire
  ces agents lors de ces manipulations.
• Lemploi de Dnase permet de limiter la formation
  daggrégats cellulaires autour de lADN libéré
  par les cellules endommagées.
• La digestion enzymatique fournit généralement une
  suspension cellulaire de viablilté supérieure à
  celle obtenue par dissociation mécanique.
  Certaines molécules de la surface cellulaire
  pourraient subir un clivage lors de lincubation
  en présence denzymes. Il faut contrôler la
  résistance de lépitope spécifique des anticorps
  monoclonaux utilisés en immunomarquage.

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Tests Fonctionnels

• Les cellules analysées en cytométrie de flux
  après immunomarquage peuvent être triées sur base
  de lexpression de certaines molécules et ensuite
  utlisées dans des tests fonctionnels (migration,
  cycle cellulaire, expansion clonale,).
• Dans ce type dapplication, la viabilité des
  cellules est essentielle elle sera évaluée dès
  le départ des manipulations
• Bleu Trypan (colorant vital)
• Iodure de Propidium (se lie à lADN des
  cell.mortes)
• Les cellules endommagées ou mortes, susceptibles
  dentraîner la formation daggrégats, seront
  retirées de la suspension cellulaire par
  filtration sur
  filtre de nylon par ex.
  
  
  ou centrifugation en gradient de
  densité.
• La survie sera assurée par une incubation en
  milieu nutritif (Milieu de Culture RPMI 1640 ou
  solution saline de Hanks) dépourvu dindicateur
  coloré tel que Rouge phénol. Le pH du milieu doit
  être maintenu stable (utilisation de Hepes
  possible).
• Des protéines, saturation des sites de liaison
  non-spécifiques, seront ajoutées dans le milieu
  dincubation. BSA ou sérum, ce dernier sera
  décomplémenté car il pourrait activer le clivage
  de certaines molécules de la surface cellulaire.
• La T sera maintenue à 4C après immunomarquage
  car la présence danticorps liés à certaines
  structures de la membrane plasmatique peut
  induire du  capping  voire de linternalisation
  des structures recherchées.

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Perméabilisation

• Etape nécessaire pour la détection dantigènes
  intracellulaires ( enzymes, cytokines) par
  immunomarquage.
• Les anticorps couplés sont des macromolécules de
  taille importante, leur entrée dans la cellule
  requiert une perméabilisation préalable ou
  simultanée à létape dimmunomarquage.
• En même temps éviter la diffusion de
  lantigène recherché
• conserver les
  caractéristiques FSC/SSC des cellules
• Ces conditions sont rencontrées en fixant
  les cellules (paraformaldéhyde) de façon à
  stabiliser les membranes et ensuite en incubant
  en présence des anticorps, de Saponin
  (perméabilisant) et dun agent bloquant (SVF ou
  BSA pour réduire la liaison non-spécifique).
  Effectuer les lavages en présence de Saponin.
• Dautres combinaisons sont possibles, par
  ex. Méthanol/Acétone , Ethanol 70 et réactifs
  commerciaux.
• Chaque antigène recherché nécessite une mise
  au point précise qui respectera les
  caractéristiques FSC/SSC et évitera les liaisons
  aspécifiques.
  Des contrôles seront réalisés en
  parallèle.
• en présence de brefeldine les cytokines
  produites sont piégées dans la cellule.
• méthode directe ou indirecte de marquage

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Recommandations

• Les fluorochromes sont sensibles à la lumière et
  au pH.
• Les réactifs Anticorps se périment.
• Les solutions de lyse et de fixation saltèrent
  rapidement
• La qualité de limmunomarquage et de lanalyse en
  cytométrie dépend de la qualité de léchantillon
  cellulaire. Un contrôle des résultats est
  possible au microscope à fluorescence après le
  passage au cytomètre.
• Une manipulation mal entamée ne peut se corriger.
• Certains réactifs sont toxiques (Azide, PAF, IP)
  
• Il faut se protéger de la formation daérosols.
• Les prélèvements de sang humain (moelle, tissus
  lymphoides,..) sont susceptibles dêtre
  contagieux.

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Ouvrages de Références

• Cytometric Analysis of Cell Phenotype and
  Function. Eds D.A. McCarthy and M.G.Macey.
  Cambridge University Press. 2001.
• Immunophenotyping. Eds C.C.Stewart and
  J.K.A.Nicholson.Wiley-Liss.2000.
• Immunophénotypage des Leucocytes. Clusters de
  différenciation humains.
• Application à la caractérisation des
  Hémopathies O.Lees, M.C.Béné et les membres du
  GEIL. Biothem Editions. 1998.
• Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory
  Practice. M.A.Owens and
• M.R.Loken.Eds Wiley-Liss. 1995.