STRUCTURE%20DE%20LA%20MEMBRANE

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STRUCTURE DE LA MEMBRANE
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II - LES PROTÉINES MEMBRANAIRES

• Porteuses de la plupart des fonctions des
  membranes
• Variable en fonction du type de cellule
• myéline protéines ? 25 de la masse
• membrane interne des mitochondries protéines ?
  75 de la masse
• en général protéines ? 50 de la masse
• 50 molécules de lipide pour une molécule de
  protéine
• Souvent glycosylées

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A - Rapports lipides - protéines
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Fig 10-17 (1à4)
Modes d'insertion des protéines dans la double
couche lipidique (1/2)
Cylindre ?

• Simple hélice ?

Multiple hélice ?
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Fig 10-17 ( 5 à 8)
Modes d'insertion des protéines dans la double
couche lipidique (2/2)

• ? Phosphatidyl inositol
• Au départ protéine transmembranaire à un passage
  dans le RE

? Chaine d'acide gras ou groupe prényl. Au départ
protéine cytosolique soluble
6
Protéines liées aux lipides Exemple 5

• Synthèse de la protéine dans le cytosol comme une
  protéine soluble
• Fixation d'un lipide par liaison covalente
• Transport vers la membrane

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Fig 10-18

• Exemple 5 attachement d'une protéine
  membranaire par une chaîne d'acide gras ou un
  groupement prényl

8
Exemple 5 attachement d'une protéine
membranaire par une chaîne d'acide gras ou un
groupement prényl

• Aide à localiser une protéine soluble dans la
  membrane
• Peut être transitoire

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Exemple 6 protéines liées aux lipides

• Synthèse de la protéine dans le RE comme une
  protéine transmembranaire à un passage
• Dans le RE le segment transmembranaire de la
  protéine est clivé
• Un GlycosylPhosphatidylnositol (GPI) est ajouté
• La protéine se retrouve liée à la face non
  cytosolique de la membrane
• Facile à reconnaître grâce à une phospholipase C
  spécifique du phosphatidylInositol

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Fig 10-17 ( 5 à 8)
Modes d'insertion des protéines dans la double
couche lipidique (Rappel)
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Exemples 7 et 8 protéines périphériques

• Liaisons non covalentes avec d'autres protéines
  de la membrane
• Peuvent être libérées par les procédés
  d'extraction doux (force ionique ou pH)

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Protéines intégrales

• protéines intrinsèques
• Nécessitent des procédés énergiques pour être
  libérées

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Protéines membranaires

• Transmembranaires
• agissent des deux côtés de la membrane
• transport de molécules
• comprennent les récepteurs
• reconnaissance extra cellulaire
• message intra cellulaire
• Non transmembranaires
• associées aux lipides et/ou protéines d'une seule
  face de la membrane
• eg médiation chimique intra cellulaire (moitié
  cytosolique de la membrane)

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Protéines transmembranaires

• Toujours orientation unique dans la membrane
• Dû à la synthèse dans le réticulum endoplasmique
• Presque toujours en hélice ?
• Ou cylindre ?

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Fig 10-19
Hélice ?
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Fig 10-20 (AB)

• Prédiction de la localisation d'hélice ? d'une
  protéine par profil d'hydrophobicité

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Fig 10-20 C

• Proportion prévisible de protéines membranaires
  dans le génome

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Cylindres ?

• Forment une structure rigide
• facile à cristalliser (? hélice ?)
• Le nombre de plis ? peut varier de 8 à 22

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Fig 10-21 (1de2)

• Cylindres ?

E. coli
E. coli
Récepteur à un virus bactérien
Lipase
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Fig 10-21(2de2)
L'intérieur est comblé par un domaine globulaire
de protéine qui contient un site de fixation du
fer

• Cylindres ?

Rhodobacter capsulatus
E. coli
Transporteur d'ions
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Les Cylindres ?

• Abondants dans la membrane externe des
  mitochondries
• Forment des pores (eg porine)
• Souvent boucles qui font saillie dans la lumière
• Parfois porines spécifiques (maltoporines)
• Surtout membranes externes des bactéries,
  mitochondries, chloroplastes
• Beaucoup plus rares que hélices ? chez les
  eucaryotes
• Plus rigides que l'hélice ?

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Forrest,LR2000(Fig1) Review Membrane
simulations bigger and better?

• Simulations d'une hélice de protéine
  transmembranaire dans une bicouche lipidique.
  Simulations de (a) 18-mer, (b) 26-mer and (c)
  34-mer modèles de l'hélice ? de la protéine
  transmembranaire M2 du virus influenza A dans une
  bicouche lipidique

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Forrest,LR2000(Fig2) Review Membrane
simulations bigger and better?

• Simulations de canaux ioniques dans une bicouche
  lipidique. (a) Hélice M2?5 (b) Canal potassique
  KcsA

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B - Glycosylation des protéines membranaires
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Fig 10-22

• Protéine transmembranaire à un passage glycosylée
• Glycosylation dans le RE et Golgi ?
• La face glycosylée est la face non cytosolique
• Ponts SS sur la face non cytosolique

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C - Détergents

• Petites molécules amphiphiles
• Permettent de solubiliser les protéines
  transmembranaires
• Extrémité polaire chargée (ionique) sodium
  dodécyl sulfate (SDS)
• Extrémité polaire non chargée (non ionique)
  triton

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Fig 10-23

• Micelle de détergent dans l'eau

28
Fig 10-24

• Solubilisation de protéines membranaires par un
  détergent léger il y a solubilisation des
  protéines membranaires et des phospholipides de
  la membrane

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Fig 10-25

• SDS détergent anionique
• Triton X-100 détergent ionique
• Portion hydrophobe du détergent en vert
• Portion hydrophile du détergent en bleu

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SDS - Page

• Solubilisation des protéines par SDS
  solubilisation de la protéine avec dénaturation
  (déroulement)
• Parfois réversible
• Electrophorèse en Gel de PolyAcrylamide (PAGE)
• A révolutionné l'étude des protéines membranaires

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Fig 10-26

• Utilisation de détergents légers pour
  solubiliser, purifier et reconstituer des
  systèmes de protéines fonctionnels
• Très bel exemple

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D - Les globules rouges

• Hématies érythrocytes
• Facilement disponibles
• Faciles à isoler
• Pas de noyau, pas d'organite interne
• Une seule membrane membrane plasmique
• Création de fantômes membranaires

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Fig 10-27

• Globules rouges en microscopie électronique à
  balayage

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Fig 10-28

• Préparations de fantômes de globules rouges
• refermés ou non
• retournés ou non

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Méthodes

• Marquage "vectoriel" marqueur radioactif ou
  fluorescent soluble (ne se fixe que sur la face
  exposée)
• Enzymes protéolytiques
• Anticorps marqués
• SDS-PAGE

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Résultats

• Certaines protéines traversent la bicouche
  lipidique
• La composition des deux feuillets lipidiques est
  différente

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Fig 10-29

• SDS-PAGE des protéines de la membrane du globule
  rouge humain ? environ 15 protéines majeures
  (15000 à 250000 D)
• Spectrine glycophorine bande 3 gt 60 en
  masse des protéines membr anaires

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a- Spectrine

• Protéine du cytosquelette associée à la face
  cytosolique de la membrane du globule rouge
• Principal constituant du cytosquelette qui donne
  sa forme biconcave au GR
• Permet au GR de se déformer pour passer dans les
  petits capillaires
• Mutations dans le gène de la spectrine ? anémie
  avec GR sphériques (sphérocytose héréditaire
  Minkowski-Chauffard)
• 25 en masse des protéines associées à la
  membrane
• Longueur 100 nm (250 000 copies / cellule)

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Fig 10-30 A

• Molécules de spectrine du GR humain
• Hétérodimère qui forme des tétramères
• deux chaînes polypeptidiques ? et ? anti
  parallèles enroulées
• extrémité phosphorylée pour former le tétramère

40
Fig 10-30 B

• Molécules de spectrine du GR humain en
  microscopie électronique

41
Fig 10-31 A

• Hétérodimère qui forme des tétramères (200 nm de
  long)
• 4 ou 5 tétramères sont liés dans des complexes de
  jonction qui contiennent actine (13 monomères)
  bande 4.1, adducine et tropomyosine

42
Liaison de spectrine à la membrane

• Ankyrine
• Liaison de la spectrine à la membrane
• Se lie à
• spectrine
• bande 3 (protéine transmembranaire)
• Limite la diffusion latérale de bande 3
• Bande 4.1
• Liaison de la spectrine à la membrane
• Se lie à
• spectrine et ankyrine
• bande 3 et glycophorine

43
Fig 10-31B

• Spectrine du cytosquelette de la face cytosolique
  du GR humain en microscopie électronique
  (coloration négative)

44
Autres cellules que le GR

• Beaucoup plus compliqué
• Cortex du cytosol riche en actine
• Cf. chapitre cytosquelette

45
b - Glycophorine

• Une des premières protéines membranaires à être
  séquencée
• 1 million de molécules par cellule
• 131 acides aminés
• Fonction inconnue
• N'existe que dans le GR
• Type de la molécule transmembranaire à un passage

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Glycophorine

• En général homodimère
• Extrémité -N à l'extérieur
• 100 résidus glucose (90 des sucres de la
  membrane du GR)
• Un passage hélice ? hydrophobe de 23 acides
  aminés

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Fig 10-32

• Transformation d'une chaîne protéique à
  plusieurs passages en deux chaînes protéiques à
  plusieurs passages

A et B même résultat A un gène B deux gènes
48
c - Bande 3

• Protéine transmembranaire de 930 acides aminés
• 12 passages
• Transport du CO2 des tissus vers les poumons
• Transporteur d'anions qui permet à HCO3- de
  traverser la membrane
• Se voit en cryofracture

49
Photo de Branton

• Daniel Branton (1932 - )

50
Fig 10-33

• Congélation dans l'azote liquide
• Fracture du bloc de glace avec un couteau
• Le plan de fracture passe entre les deux
  feuillets hydrophobes de la membrane
• Les plans de fracture sont ombrés au platine
• Examen de la réplique au microscope électronique
  à transmission

51
Cryofracture

• Face P(rotoplasmique) face E(xterne)

52
Fig 10-34

• Globule rouge humain en cryofracture
• Surtout bande 3

53
ME cryofracture
54
Fig 10-35

• Devenir probable des molécules de glycophorine et
  bande 3 du GR humain pendant la cryofracture

La protéine tend à rester avec le feuillet qui
contient la plus grosse partie de la protéine
55
E - Bactériorhodopsine

• Protéine de transport de la membrane plasmique
  dont on connaît bien la structure 3D dans la
  bicouche lipidique
• Pompe à protons activée par la lumière de la
  membrane plasmique de certains archaea
• Structure semblable à de nombreuses autres
  protéines de membrane

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Fig 10-36

• Halobacterium salinarum
• Archeae
• Vivent en eau salée et au soleil
• Possèdent des "patch" dans leur membrane
  plasmique appelée "membrane pourpre"
• Chaque patch ne contient qu'une sorte de
  protéine la bactériorhodopsine

57
Halobacterium Salinarum cells, as seen with a
dark-field optical microscope

• www.ib.pi.cnr.it/groups/ halob/flabat.html

58
Halobacterium salinariumis an extreme halophile
that grows at 4 to 5 M NaCl and does not grow
below 3 M NaCl. This freeze etched preparation
shows the surface structure of the cell membrane
and reveals smooth patches of "purple membrane"
(bacteriorhodopsin) embedded in the plasma
membrane.

• http//images.google.fr/imgres?imgurlsoils1.cses.
  vt.edu/ch/biol_4684/Microbes/halobacterium2.gifim
  grefurlhttp//soils1.cses.vt.edu/ch/biol_4684/Mic
  robes/halo.htmlh300w244prev/images3Fq3Dhal
  obacterium2Bsalinarum26svnum3D1026hl3Dfr26lr
  3D26ie3DUTF-826sa3DN

59
Lyophilized purple membranes

• Extremely halophilic microrganisms of the Archaea
  domain produce a purple membrane, the chromophore
  consisting of a retinal-protein complex called
  bacteriorhodopsin

60
Top view of the purple membrane patch. The
hexagonal unit cell is displayed in the middle of
the patch, surrounded by white line defining the
unit-cell dimensions.
61
Krebs,MP2000p15 (fig2)

• (A) Vue latérale dun monomère de
  bactériorhodopsine comme on le voit dans le
  trimère
• (B) Vue cytoplasmique de la membrane pourpre

62
Bacteriorhodopsin contient un groupe absorbant
la lumière ou chromophore (le rétinal)

• http//www.biologia.uniba.it/fisiologia/corcelli/e
  n/br.htm

63
Rétinal

• vitamine A dans sa forme aldéhyde
• Le même chromophore que dans la rhodopsine de la
  rétine
• Lié de façon covalente à une lysine de la protéine

64
Krebs,MP2000p15 (fig4)
65
Fontionnement de la rhodopsine

• Un photon ? le chromophore change de forme ?
  modification de la conformation de la protéine ?
• Transfert d'un ion H du cytosol vers l'extérieur
  de la cellule

66
Fig 10-37

• Bactériorhodopsine

7 hélices ? de 25 acides aminés chacune
67
Fontionnement de la rhodopsine

• Le transfert du proton entraîne un gradient
• qui entraîne la formation d'ATP
• grâce à une seconde protéine ?
• Sorte de pile solaire

68
Bactériorhodopsine

• Modèle pour beaucoup d'autres protéines à 7
  passages
• Bactériorhodopsine (transporteur)
• Transmetteurs de signaux

69
Fig 10-38

• Autre exemple (que bactériorhodopsine)
• Structure 3D du centre de photosynthèse de
  Rhodopseudomonas viridis
• 4 sous-unité L,M,H, cytochrome
• Première protéine transmembranaire à être
  cristallisée et analysée

70
F - Diffusion latérale des protéines

• Flip flop non
• Diffusion rotatoire oui
• Diffusion latérale oui
• Hétérocaryons
• FRAP
• FLIP

71
Fig 10-39

• Hétérocaryon Homme/Souris de L.D. Frye M.
  Edidin (1970)

72
Fig 10-40 FRAP

• Fluorescence recovery After Photobleaching

73
Fig 10-40 FLIP

• Fluorescence Loss In Photobleaching

74
Domaines membranaires

• Membrane mer de lipides protéines qui
  flottent dedans ? simpliste
• Confinement de protéines dans des domaines
  spécifiques de la cellule
• Cellule épithéliale (intestin ou rein)
• Distribution asymétrique des protéines
• Distribution asymétrique des lipides
• Pas d'échange de lipides ou protéines entre les
  domaines des feuillets externes
• Rôle des tight junctions (jonctions étanches
  jonctions serrées)

75
Fig 10-41

• Limitation de la mobilité d'une protéine
  membranaire dans un domaine cellule épithéliale

76
Application au spermatozoïde

• Création domaines membranaires sans jonctions
  intercellulaires
• Trois domaines distincts (au moins)
• région acrosomique
• région post acrosomique
• queue
• Barrière inconnue

77
Fig 10-42

• Spermatozoïde de cobaye
• Anticorps spécifique de chaque région

78
Autres exemples

• Cellule nerveuse
• Axone
• Dendrite
• Beaucoup d'autres

79
Mécanismes d'immobilisation des protéines

• Halobacterium "membrane pourpre" cristal qui
  immobilise et limite la diffusion
• Assemblages macromoléculaires à l'intérieur ou à
  l'extérieur de la membrane
• eg GR cf. supra

80
Fig 10-43

• Quatre mécanismes de restriction de la mobilité
  latérale de protéines spécifiques de la membrane
  plasmique
• (A) - auto-assemblage en gros agrégats (eg
  "membrane pourpre")
• (B) - assemblage à l'extérieur de la cellule
• (C) - assemblage à l'intérieur de la cellule
• (D) - entre deux cellules