Inmunohistoqumica

1
Inmunohistoquímica

• Detección del antígeno en un determinado tipo
  celular
• Detección de anticuerpos contra antígenos
  tisulares

Reactivo? anticuerpo Especificidad dada por la
interacción epitope/paratope Sustrato ?
muestra histológica Especificidad dada por la
ubicación del antígeno en el tipo celular
esperado.

• Muestras Histológicas
• Porción de tejido
• Suspensión celular
• Cultivo celular
• Línea célular transfectada
• Línea celular diploide o heteroploide

2
(No Transcript)
3
(No Transcript)
4

• Tratamiento del tejido
• No fijados
• No se pueden almacenar por mucho tiempo
• (se degradan por autólisis celular).
• Requieren cadena de frío (lt -70ºC) para
• mantener la integridad celular y antigénica.
• Conserva mas la integridad del Ag y de las
  células
• Fijados
• Puede alterar o destruir la antigenicidad
• Mas perjudicial para monoclonales.
• Puede alterar la morfología celular
• Evita la autólisis celular
• Inactiva las proteasas celulares
• Permite almacenar el tejido indefinidamente
• Pueden ser archivados en histotecas.
• Le confiere rigidez al tejido

5

• Células en suspensión
• 1) Inmovilizadas en portaobjetos
• 2) Fijación suave con Acetona helada (-20ºC)
• 3) Listas para la inmunomarcación
• 1) Mantenidas en suspensión
• 2) No requiere de fijadores
• 3) Luego de distintos lavados se realiza la
  inmunomarcación

Tejidos fijados
Fijadores Endurecen al tejido e inmovilizan sus
constituyentes. Evita la disgregación de los
componentes del tejido a lo largo de
la inmunomarcación Preservan la relación
estructural del tejido. Formol Paraformaldehido
Bouin Solución saturada de ácido pícrico para
formaldehido 4 acético
1 Glutaraldehido Paraformaldehído4/Glutaraldeh
ído 0.2 Metanol 95/Acético 5 Tetróxido de
Osmio Periodato Acetona (reversible) Metanol (
)
6
Qué fijador usar?
No existen reglas fijas
Trozos de tejidos Formol Formol/PBS
Paraformaldehído Bouin. Monocapas celulares
Paraformaldehído-Glutaraldehído Paraformaldehíd
o MetOH/AcH Acetona.
Microscopía Electrónica Glutaraldehído/Formaldehí
do
Corte Histológico Se realiza en trozos de tejido

• Crióstato cortes por congelación.(Tejidos no
  fijados).
• Vibrátomo Trozos de tejido previamente fijados
  pero no
• incluídos en resinas o parafina.
• Micrótomo Trozos de tejido previamente fijado e
  incluídos en
• parafina o en cualquier resina epoxi. La
  parafina le
• da al tejido la textura necesaria para
  poder cortarse
• en el micrótomo.

7
Protocolo de inmunomarcación

• 1- Permeabilización con detergente (Tritón X-100)
  (Opcional)
• 2- Bloqueo con PBS proteína inerte (Albúmina,
  Gelatina, etc.)
• 3- Incubación (1 hora a TA u ON a 4C) con el 1º
  Ac diluído
• en PBSProteína2 Tween-20
• 4- Lavados con PBS-Tween-20
• 5- Incubación con 2º Ac conjugado (Enzima o
  Fluorocromo)
• diluído en PBS-Tween (1 hora a TA u ON a
  4C).
• 6- Idem 4
• 7- Revelado
• 8- Visualización
• Microscopio
• Citómetro de flujo

8
Islet Cell Antibody (ICA)
Suero
Suero -
9
Células CHO-GAD
10
Inmunogold Combina inmunohistoquímica con
microscopía electrónica
Pre-embedding
Post-embedding
11
(No Transcript)
12
Definición de los parámetros de performance
analítica mas relevantes para validar un test
inmunohistoquímico (FDA) Sensibilidad
Capacidad para detectar pequeñas cantidades de
antígeno. Incluir un tejido con tinción positiva
débil. Especificidad Ausencia de tinción en
otros tipos celulares. Incluir un control
negativo . Precisión Para monitorear todos los
pasos del análisis. Incluir un control que tenga
tanto células negativas como Positivas. Agudeza E
valuar la tinción inespecífica y el
background. Incluir un control negativo en lugar
del anticuerpo primario.
13
Islet Cell Antibody (ICA)
Suero
Suero -
Células CHO-GAD
14
(No Transcript)