CONCEPTOS B

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CONCEPTOS BÁSICOS DE INMUNOLOGÍA PARA
BIOTECNÓLOGOS
Dario C. Ramirez Dr en Bioquímica Magister en
Inmunología
Contacto Laboratorio de Medicina Experimental y
Terapéuticas Cátedra de Genética Molecular
E-mail ramirezlabimibiosl_at_ymail.com /
moleculargenetics.unsl_at_gmail.com Facebook
ramirezlabimibiosl
Licenciatura en Biotecnología 2013
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Overview
1- Breve reseña historica y conceptos de
inmunología 2- El sistema inmunológico 3-
Anticuerpos o inmunoglobulinas 4- La respuesta
inmunológica 5- Antígenos, hapteno, adyuvantes e
inmunogenos 6- Anticuerpos policlonales/monoclona
les 7- Marcado de anticuerpos 8- Interacción
antigeno-anticuerpo 9- Vacunas y Técnicas
inmunoquímicas 10- Aplicaciones de los
inmunoreactivos en biotecnología
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Orígenes de la Inmunología
El primer acercamiento a la inmunización con
criterios racionales fue realizado por el médico
inglés Edward Jenner (1749-1823) en la imagen
superior, tras su constatación de que las
tamberas que habían adquirido la viruela de la
vaca o vacuna (una forma benigna de enfermedad
que sólo producía pústulas en las manos) no eran
atacadas por la grave y deformante viruela
humana. En 1796 inoculó a un niño, fluido
procedente de las pústulas vacunales de Sarah
Nelmes semanas después el niño fue inyectado con
pus de una pústula de un enfermo de viruela,
comprobando que no quedaba afectado por la
enfermedad. El primer abordaje se debió a
Louis Pasteur (imagen inferior). Estudiando la
bacteria responsable del cólera aviar
(Pasteurella aviseptica), observó (1880) que la
inoculación en gallinas de cultivos viejos y poco
virulentos de esa bacteria, las protegía de
contraer la enfermedad cuando posteriormente eran
inyectadas con cultivos normales virulentos. De
esta forma se obtuvo la primera vacuna a base de
microorganismos atenuados.
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CONCEPTO DE INMUNIDAD INMUNIDAD Reacción frente a
sustancias extrañas, incluido microorganismos y
macromoléculas como proteínas y polisacáridos,
sin implicar las consecuencias fisiológicas o
patológicas de tal reacción. LA INMUNOLOGÍA es
el estudio de la Inmunidad en su sentido amplio y
de los acontecimientos celulares y moleculares
que se producen después que nuestro organismo se
encuentra con microorganismos u otras moléculas
extrañas.
5
(No Transcript)
6
El sistema inmunológico
7
Vías de Ingreso de los Antígenos
8
Células del Sistema Inmune
9
Mecanismos de Defensa Inespecíficos y Específicos
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CARACTERISTICAS DE LOS MECANISMOS INMUNIDAD
NATURAL INMUNIDAD ESPECIFICA Están presentes
antes Son inducidos por la ex- de la
exposición posición No aumentan con
las Aumentan con cada exposiciones
exposición Son inespecíficos Son
exquisitamente específicos
Hay memoria inmunitaria
Amplifica los mecanismos de la
inmunidad natural
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ANTICUERPOS
Anticuerpos policlonales y monoclonales
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La respuesta inmunitaria humoral está mediada por
moléculas de anticuerpo que secretan las células
plasmáticas
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Inmunoglobulina o anticuerpo
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Isotipos de inmunoglobulinas
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PROPIEDADES DE LAS INMUNOGLOBULINAS
Estructura y características fisico-químicas
Funciones efectoras
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La respuesta inmunológica Producción de
anticuerpos
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• CARACTERISTICAS DE LA RESPUESTA INMUNE
• ESPECIFICIDAD
• DIVERSIDAD
• MEMORIA
• AUTOLIMITACION
• DISCRIMINACION
• ESPECIALIZACION

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ANTÍGENO Y ADYUVANTE

• Es capaz de despertar una respuesta inmunitaria
  en un individuo inmunologicamente competente.
• El antígeno puede ser el propio agente (bacterias
  o virus), fragmentos de él (flagelos, fimbrias),
  o proteínas y polisacáridos de su superficie.

• Los adyuvantes son sustancias o preparados
  químicos que, incorporados al antígeno o
  inyectados simultáneamente con él, hacen más
  efectiva la respuesta inmune. Con su empleo se
  logra una economía de antígeno y de tiempo, así
  como un mayor nivel de anticuerpos específicos.

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• HAPTENOS
• Moléculas incapaces de inducir una respuesta
  inmune por sí solas , no obstante si se asocia
  con otra molécula llamada portadora (carrier)
  logran inducir la producción de anticuerpos.
• Suelen ser moléculas proteicas de bajo peso
  molecular o moléculas químicas no proteicas.
• La respuesta inmunitaria puede llevar a la
  producción simultánea de anticuerpos contra el
  Hapteno y contra el carrier.
• HAPTENO CARRIER INMUNOGENO

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• CARACTERISTICAS ASOCIADAS CON LA INMUNOGENICIDAD
  Y CANTIDAD DE INMUNOGENO
• La producción de una adecuada respuesta inmune
  requiere una determinada concentración del
  antígeno muy pequeñas cantidades o grandes
  cantidades pueden alterar la respuesta inmune
• Pequeñas cantidades inoculadas repetidamente
  pueden inducir tolerancia.
• Grandes cantidades de antígeno pueden dar lugar a
  parálisis inmunológica.

21
(No Transcript)
22
Inmunoglobulina anticuerpo
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Inmunoglobulina
No todos los anticuerpos son Gammaglobulinas
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Producción de anticuerpos policlonales
25
(No Transcript)
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Anticuerpos monoclonales
Anticuerpos idénticos que se unen con un antígeno
específico y son producidos por un tipo de
linfocito B híbrido inmortal con capacidad
ilimitada de producción.
Anticuerpos Monoclonales
Importante avance para inmunología.
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Anticuerpos monoclonales
Anticuerpos idénticos que se unen con un antígeno
específico y son producidos por un tipo de
linfocito B híbrido inmortal con capacidad
ilimitada de producción.
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(No Transcript)
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Anticuerpos policlonales vs anticuerpos
monoclonales

1. Mayor homogeneidad.
2. Reproductibilidad de sus efectos, como
   consecuencia de su homogeneidad.
3. Mayor capacidad potencial de seleccionar los
   mejores anticuerpos en afinidad, tipo de
   reconocimiento.

Ventajas sobre Anticuerpos Policlonales

• Monoclonal
• Mouse or rabbit hybridoma
• Tends to be cleaner
• Very consistent batch-to-batch
• More likely to get false negative results

• Polyclonal
• Many different species
• Tends to have more non-specific reactivity
• Can have very different avidity/affinity
  batch-to-batch
• More likely to have success in an unknown
  application

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Inmunoreactivos derivados de los anticuerpos
http//en.wikipedia.org/wiki/List_of_monoclonal_an
tibodies
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Aplicaciones biotecnológicas de los anticuerpos
monoclonales

• Identificación de Marcadores Fenotípicos
  Distintivos de Tipos Celulares Concretos.
• Inmunodiagnóstico (Inmunoanálisis).
• Diagnóstico y Monitoreo (vitaminas, drogas,
  hormonas, citocinas, enfermedades, marcadores
  tumorales, enzimas).
• Tratamiento (Artritis Reumatoide, Leucemias de
  Linf. B, Cáncer de Mama, de Cólon).
• Análisis Funcional de Moléculas de Superficie y
  Secretadas.
• Catálisis
• Biosensores (moléculas orgánicas e inorgánicas).

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INTERACCION ANTIGENO - ANTICUERPO
Especificidad y reversibilidad
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Los antígenos pueden unirse a cavidades,
hendiduras o superficies extendidas en el sitio
de unión de las moléculas de anticuerpo
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FUERZAS NO COVALENTES QUE MANTIENE UNIDO EL
ANTIGENO AL ANTICUERPO
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Antígenos vs epitopes
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(No Transcript)
37
(No Transcript)
38
(No Transcript)
39
(No Transcript)
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• USO DE LOS INMUNOREACTIVOS
• VACUNAS
• TECNICAS INMUNOQUIMICAS

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VACUNAS
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Inmunización mediante las Vacunas
La Inmunización es la técnica de medicina
preventiva cuyo objetivo consiste en procurar
resistencia inmune frente a un organismo
infeccioso. Con este fin, se inocula al individuo
una forma del organismo patógeno que no tiene
capacidad de producir la enfermedad, pero si de
inducir la formación de anticuerpos. Este proceso
se denomina también vacunación debido a que la
primera técnica de inmunización consistió en la
administración del virus de la viruela vacuna
para lograr la inmunidad frente a la viruela. El
preparado inmunizante se introduce en el
organismo a través de la piel (inoculación),
salvo algunas excepciones, como la vacuna oral de
la polio tipo Sabin. La duración del efecto
protector es muy variable, desde seis meses en el
caso de la peste hasta diez años para la fiebre
amarilla. Las vacunas son la forma más eficaz de
protección frente a los agentes patógenos contra
los que los antibióticos no son eficaces, por
ejemplo los virus. En los países occidentales se
administran ciertas vacunas de acuerdo a un
calendario oficial de vacunación. Las vacunas se
preparan con microorganismos muertos por la
exposición al calor o a agentes químicos (como la
primera vacuna de la polio desarrollada por Jonas
Salk, en la imagen superior, o la vacuna de la
fiebre tifoidea) con un toxoide, forma
inactivada de la toxina producida por el
microorganismo (vacunas del tétanos y la
difteria) o con un virus vivo atenuado, es
decir, un virus debilitado en el laboratorio de
manera que no produzca la enfermedad (como la
vacuna de la polio desarrollada por Albert Sabin
(en la imagen inferior), o las vacunas del
sarampión y la fiebre amarilla).
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Las Vacunas
Una Vacuna es un preparado de antígenos
procedentes de microorganismos patógenos, cuya
finalidad es la creación de anticuerpos que
reconozcan y ataquen a la infección y, por lo
tanto, produzcan la inmunidad del organismo
inoculado. La vacuna suele consistir en dosis muy
pequeñas del propio agente (forma inactiva o
atenuada) que origina la enfermedad, por lo que
provoca la creación de anticuerpos que permanecen
en el organismo y lo protegen en el caso de
futuros contagios. La técnica de administración
depende del tipo de vacuna la más común es la
inoculación, pero en algunos casos es la
ingestión o el spray nasal.
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Los Sueros
La inmunidad artificial pasiva se adquiere cuando
al sujeto se le administra directamente
anticuerpos específicos para un patógeno
determinado. Los anticuerpos producen inmunidad
rápidamente (unas pocas horas), pero su efecto no
es de larga duración (sólo unos meses), debido a
que no se activa la memoria inmunológica. Estos
anticuerpos reciben el nombre de suero o
antídoto. Este tipo de sueros se utilizan para
inmunizar contra el tétanos, la difteria, la
hepatitis (A y B), etc. .
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TIPOS TRADICIONALES DE VACUNAS

• Inactivadas microorganismos dañinos que han sido
  tratados con productos químicos o calor y han
  perdido su peligro. Ejemplos de este tipo son la
  gripe, cólera, peste bubónica y la hepatitis A.
  La mayoría de estas vacunas suelen ser
  incompletas o de duración limitada, por lo que es
  necesaria más de una toma.
• Vivas atenuadas microorganismos que han sido
  cultivados expresamente bajo condiciones en las
  cuales pierden sus propiedades nocivas. Suelen
  provocar una respuesta inmunológica más duradera,
  y son las más usuales en los adultos. Por
  ejemplo la fiebre amarilla, sarampión o rubéola
  (también llamada sarampión alemán) y paperas.

• Toxoides son componentes tóxicos inactivados
  procedentes de microorganismos, en casos donde
  esos componentes son los que de verdad provocan
  la enfermedad, en lugar del propio
  microorganismo. En este grupo se pueden encontrar
  el tétanos y la difteria.
• Subunitarias introduce un microorganismo
  atenuado o inactivo, dentro del sistema
  inmunitario, para crear una respuesta
  inmunitaria. Un ejemplo característico es la
  vacuna subunitaria contra la hepatitis B, que
  está compuesta solamente por la superficie del
  virus (superficie formada por proteínas).

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NUEVOS TIPOS DE VACUNAS

• Conjugadas ciertas bacterias tienen capas
  externas de polisacáridos que son mínimamente
  inmunitarios. Poniendo en contacto estas capas
  externas con proteínas, el sistema inmunitario
  puede ser capaz de reconocer el polisacárido como
  si fuera un antígeno (un antígeno puede ser una
  proteína o un polisacárido).
• Vector recombinante combinando la fisiología
  (cuerpo) de un microorganismo dado y el ADN
  (contenido) de otro distinto, la inmunidad puede
  ser creada contra enfermedades que tengan
  complicados procesos de infección.

• Vacuna de ADN vacuna de desarrollo reciente, es
  creada a partir del ADN de un agente infeccioso.
  Funciona al insertar ADN de bacterias o virus
  dentro de células humanas o animales. Algunas
  células del sistema inmunitario reconocen la
  proteína surgida del ADN extraño y atacan tanto a
  la propia proteína como a las células afectadas.

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TECNICAS INMUNOQUIMICAS
Marcado de anticuerpos o sus fragmentos con fines
diagnósticos o terapéuticos
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Los inmunoensayos mas corrientes

• ELISA
• Western blot
• Immunoprecipitation
• Inmunopurificación
• Citometria de Flujo
• Immunohistochemistry

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Inmunoprecipitación
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Inmunopurificación
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Citometría de flujo
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Western blot, western blotting o inmunoblotting
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ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ELISA detects substances with antigenic
properties (mainly proteins)
Based on enzymatic color-reaction
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Basic principle of ELISA
Enzyme is used to detect the binding of Antibody
- Antigen
Enzyme converts colorless substrate into colored
product, indicating the presence of Antibody -
Antigen complex
ELISA can be used to detect either presence of
Antigens or Antibodies
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Direct and Indirect ELISA
Direct ELISA
Indirect ELISA
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Direct ELISA
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Antibody is adsorbed onto microtiter plate
Add serum to test for antigen
Specific antigen binds if contained
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Remove test fluid and unbound antigen
Binding of antigen is strong enough to withstand
rinsing
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Remove test fluid and unbound antigen
Binding of antigen is strong enough to withstand
rinsing
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
61
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
62
Add enzyme labeled antibody
Labeled antibody binds to antigens
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
63
Wash sample to remove unbound antibodies
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
64
Wash sample to remove unbound antibodies
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Wash sample to remove unbound antibodies
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
66
Add substrate
Measure color change
Positive
Negativ
E
E
E
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Direct and Indirect ELISA
Direct ELISA
Indirect ELISA
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Antigen is adsorbed onto microtiter plate
Indirect ELISA
Add serum to test for antibody
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Antigen is adsorbed onto microtiter plate
Add serum to test for antibody
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Antigen is adsorbed onto microtiter plate
Add serum to test for antibody
Wash sample
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Antigen is adsorbed onto microtiter plate
Add serum to test for antibody
Wash sample
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Add secondary antibody
Primary antibody binds to secondary anitbody
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Add secondary antibody
Wash unbound antibodies
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Add secondary antibody
Wash unbound antibodies
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Add secondary antibody
Wash unbound antibodies
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Add substrate
Measure color change
Positive
Negativ
E
E
E
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Direct vs. Indirect ELISA
Advantages of Indirect ELISA
Immunoreactivity of primary antibody is not
affected by labeling
Wide variety of secondary antibodies available on
the market
Signal amplification (several epitopes)
Advantages of Direct ELISA
Quick methodology only one AB
Cross-reactivity of second AB eliminated
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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Immobilized Antigen vs. Sandwich
Immobilized Antigen
Mainly used for antibody detection
Mainly used for antigen detection
Sandwich ELISA
Slides by Mathias Bader and Simon Loew
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(No Transcript)
81
(No Transcript)
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Inmunocito/histoquímica
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• Immunohistochemistry (IHC) combines histological,
  immunological and biochemical techniques for the
  identification of specific tissue components by
  means of a specific antigen/antibody reaction
  tagged with a visible label. IHC makes it
  possible to visualize the distribution and
  localization of specific cellular components
  within a cell or tissue.

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What cellular antigens can we target?

• Cytoplasmic
• Nuclear
• Cell membrane
• Lipids
• Proteins

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(No Transcript)
86
(No Transcript)
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Examine cytoskeletal structure
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Rol del biotecnólogo en el desarrollo de
inmunoreactivos y vacunas
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(No Transcript)
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Immuno-spin trapping
Protein
Cell
Tissue
Whole animal
Stress Reactive chemical species
Detection of nitrone adducts

• Heterogeneous Immunoassays
• Mass spectrometry (MS)
• Molecular magnetic resonance imaging (mRMRI)

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C
92
Immunospecific molecular probe
93
(No Transcript)
94
Bibliografía básica
Immunoassays in Agricultural and Biotechnology.
John Willey Sons. 2011. http//www.amazon.com/Im
munoassays-Agricultural-Biotechnology-Guomin-Shan/
dp/047028952X/refsr_1_5?sbooksieUTF8qid13687
31369sr1-5keywordsimmunoassayreader_047028952
X
The Immunoassay Handbook, Fourth Edition Theory
and applications of ligand binding, ELISA and
related techniques

• Tijssen, P. Practice and Theory of Immunoassays.
  Vol 15. In Laboratory Techniques in Biochemistry
  and Molecular Biology. Elsevier. USA 1985. 549
  Pags. ISBN 0-444-80634-2.
• Abbas, Abul K. Inmunología Celular Y Molecular.
  Elsevier España. 5ª edición. España 2004. 563
  págs. ISBN 9781416023890