Title: RIA
1RIA
- Inmunoanálisis Radiométrico
2Aplicaciones del RIA
- Determinación de la concentración de un antígeno
presente en una muestra problema. - Determinación de los parámetros de interacción
primaria (concentración y afinidad) del
anticuerpo (Mab o Pab). - Control de calidad de biomoléculas (test de
paralelismo) - Estudios de inmunorreactividad cruzada
(especificidad y selectividad).
3Fundamento Competición por el sitio de unión al
anticuerpo, entre el antígeno marcado
radiactivamente (trazador) y el antígeno no
marcado (antígeno frío).
Ac Ag
Ac Ag
k1
b
f
Ac Ag
Ac Ag
k2
b
f
Si k1k2
TCfb
Bb/TC100
4Método sensible para detectar un antígeno(Ag)
presente en una muestra problema
- Para esto se deben cumplir con ciertos
requisitos - El trazador ( Ag marcado) debe estar en muy baja
cc ( 0.1/k). - El anticuerpo debe ser especifico y con una alta
afinidad por el antígeno y debe hallarse en
concentración del órden de 1/k. - Las inmunorreactividades del antígeno marcado y
del antígeno frío deben ser idénticas frente al
anticuerpo. - La interacción Ag Ac obedece a la ley de acción
de masas sin que existan efectos alostéricos ni
cooperativos. - La condición considerada luego de la interacción
Ag Ac es la del equilibrio. - Las formas libres y unidas del trazador deben ser
separables.
5Puesta a punto de un RIA
- Ensayo de titulación del Anticuerpo.
- Curva dosis-respuesta para determinar el rango
útil de detección.
6Titulación del Anticuerpo Objetivo encontrar
la dilución del Ac capaz de captar el 50 del
trazador agregado (B/F1)
- Concentración fija de trazador en todos los
tubos(10000 cpm) - Diluciones crecientes de Anticuerpo.
- Diluyente .
- Control de unión inespecífica ( con suero no
inmune ). - Tubo de cuentas totales ( CC de trazador
utilizada en todos los tubos). - Se incuban 4º C de 1-5 días o 37º C de 2 a 18 hs
- Separación del Ag libre del unido ( PEG 6000,
Proteína A/G Sefarosa, etc). - Conteo en contador gama o beta.
7Qué dilución de Ac uso para que el ensayo sea
óptimo ?
B/F k q- k B
B ? 0
B/F k q
50
X
La dilución óptima de Ac es aquella que capta el
50 del antígeno agregado. Esa zona de la curva
es la de mayor sensibilidad y la de menor DMD
(pequeñas variaciones en la CC del antígeno
producen variaciones significativas en la
respuesta)
B 50 F 50 B/F 1 kq
q 1/ k af
82. Concentración óptima de trazador (Ag)
Actividad Específica Relación entre la
actividad (uCi) y la masa (ug) de la molécula
marcada
AE uCi/ug
El trazador debe poseer una AE suficiente para
que la masa agregada al tubo (10000 cpm) sea
infinitesimal (condición de traza). En este caso
el Bound se acerca a 0.
B/F k q- k B
B/F k q
B ? 0
De este modo, utilizando una concentración lo
suficientemente baja del antígeno marcado(
trazador), la respuesta (B/F) sólo dependerá de
los parámetros afinidad (k) y concentración (q)
del anticuerpo.
9- Trazador.
- Dilución de Ac elegida.
- Concentraciones crecientes del Standard.
- Muestra problema (Mx).
- Tubo de cuentas totales (CT).
- Unión inespecífica ( con Standard en exceso).
- Bo máxima señal ( trazador solo, en ausencia de
Ag frío).
Incubar 1-5 días a 4ºC ó 2-18 hs a 37ºC
Luego se separan lo libre de lo unido ( PEG 6000
al 15 y a 4º C Proteína A/G Sefarosa).
f
Centrifugar/decantar
Conteo (cpm/dpm)
b
10Curvas Dosis Respuesta
11- Para evitar errores de interpolación en
concentraciones extremas de Antígeno ( alta
incertidumbre) se puede realizar una
rectificación de las CDR. - Logit y ln y y B/ Bo
- 1-y Logit B/Bo ln B/Bo
- (1- B/Bo)
- Dosis(ng/ml) (B/Bo) c logit (B/Bo) c
- 0.026 0.89 2.09
- 0.052 0.79 1.32
- Mx 0.68 0.75
-
-
12Variables que afectan la sensibilidad de un RIA
- Cc del Anticuerpo
- Que pasa si pongo Ac en exceso ? La curva se
corre a - la derecha y se pierde sensibilidad. La DMD
es mayor. - Que pasa si pongo Ac mas diluido ? Al estar tan
diluido el Ac la probabilidad de que interaccione
con el trazador es menor y la señal disminuye. Se
desplaza con dosis menores. - AE UCi/ug
- Que pasa si la AE es menor ? Esto puede suceder
cuando el antígeno no esta bien purificado o
decae el radiactivo. Su masa deja de ser
despreciable. - Que pasa si la AE aumenta ? Puede alterarse la
estabilidad e inmunorreactividad del trazador.
13Otra aplicación Estudiar los parámetros de
interacción primaria mediante estimando la
afinidad (k) y la capacidad de unión (q) de los
Acs.
(monoclonal) B/F K q K B (Existe una
relacion lineal entre la señal B/F y la CC Molar
del antígeno unido al Ac (Bound).)
CURVA DE SCATCHARD
CURVA DOSIS-RESPUESTA
14Un anticuerpo monoclonal genera un gráfico de
Scatchard lineal
- m -k Afinidad del anticuerpo.
- La intersección de la recta en las abscisas es
- q concentración de sitios totales de
anticuerpos. - Conociendo por un método diferente la
concentración del anticuerpo puedo conocer la
valencia del mismo - q/(Ac).
15Un anticuerpo policlonal genera un gráfico de
Scatchard curvilíneo
qTq1q2