Biosensores

1
Biosensores

• Instrumentos analíticos que transforman procesos
  biológicos en señales eléctricas u ópticas y
  permiten su cuantificación

2
La nariz como biosensor
Aparato medidor
Detector biológico
Transductor
Célula nerviosa
Cerebro
Membrana olfatoria
3
Biosensores
Analito (sustrato)
Procesador de la señal
Señal
Transductor
Elemento biológico de detección
Elemento detector que responde al sustrato que se
está midiendo es biológico en su naturaleza
Capa delgada de material biológico activo en
contacto con transductor eléctrico
Transductor convierte cambio observado
(físico/químico) en señal cuantificable
Señal electrónica con magnitud proporcional a
concentración de un compuesto específico
Especificidad y sensibilidad de sistemas
biológicos con poder informático de
microprocesador
4
Ann NY Acad Sci, 1962
Nature, 1967
5
El analito o sustrato
cualquier sustancia consumida o producida en un
proceso biológico
paracetamol
etanol
ácido láctico
aspirina
TNT
azucares
fosfato
ácido glutámico
urea
colesterol
creatina
penicilinas
aminoácidos
6
El componente biológico
Interacción con el sustrato altamente
específica Evitando interferencias de otras
sustancias Catalización de la reacción (más
común) Unión selectiva al sustrato Otros
componentes que contienen enzimas
como Microorganismos (levaduras y
bacterias) Material tisular (plátano o
hígado) Anticuerpos Ácidos nucleicos
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El componente biológico VENTAJAS
Alta especificidad Discriminación Detección en
mezclas complejas Estructura Concentraciones S
in tratamiento previo
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Métodos de inmovilización
Componente biológico siempre en contacto íntimo
con el transductor Unión covalente o no
covalente Membrana delgada recubriendo superficie
de detección Distancia entre lugar de reacción y
lugar donde ocurre la transducción
eléctrica Adsorción a la superficie (más
simple) Microencapsulación (membranas) Atrapamient
o (matriz de gel, pasta o polímero) Unión
covalente (enlaces químicos entre componente
biológico y transductor) Entrecruzamiento (agente
bifuncional)
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Factores de rendimiento
Selectividad Característica más
importante Discriminación entre sustratos Función
del componente biológico Sensibilidad Normalment
e rango sub-milimolar (10-3 M) Casos especiales
fentomoles (10-15 M) Precisión Alrededor de 5

10
Factores de rendimiento
Naturaleza de la solución pH Temperatura Fuerza
iónica Tiempo Tiempo de respuesta más largo que
sensores químicos (30 seg) Tiempo de recuperación
(pocos minutos) Vida útil por inestabilidad del
material biológico (días a meses)
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BIOSENSORES

• Utilizan la especificidad de los procesos
  biológicos
• Enzimas x Sustratos
• Anticuerpos x Antígenos
• Lectinas x Carbohidratos
• Complementariedad de ácidos nucleicos.
• Ventajas
• Reutilización
• Menor manipulación
• Menor tiempo de ensayo
• Repetitividad
• Tipos y usos mas comercializados
• Tiras colorimétricas
• Electroquímicos
• Potenciométricos Glucosa, Lactato, Glicerol,
  Alcohol, Lactosa, L-aminoácidos, Colesterol
• Amperométricos Glucosa, Sacarosa, Alcohol
• Ópticos BIAcore Ag proteicos.

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Propiedades de un buen Biosensor
13
(No Transcript)
14
BIOSENSORES

• Control de metabolitos críticos durante las
  operaciones quirúrgicas.
• Consultas y Urgencias Hospitalarias
• Obvia análisis caros y lentos en laboratorios
  centrales
• Acelera la diagnosis y el comienzo del
  tratamiento
• Menor riesgo de deterioro de la muestra
• Diagnóstico Doméstico
• Ensayos de Embarazos
• Control de Glucosa en diabéticos
• Aplicaciones in vivo
• Páncreas artificial
• Corrección de niveles de metabolitos
• Problemas Miniaturización y Biocompatibilidad
• Aplicaciones Industriales, militares y medio
  ambientales
• Alimentación
• Cosmética
• Control de Fermentaciones
• Controles de Calidad
• Detección de Explosivos
• Detección de gases nerviosos y/o toxinas
  biológicas

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TIPOS DE BIOSENSORES

• BIOSENSORES ELECTROQUÍMICOS
• Amperométricos Determinan corrientes
  eléctricas asociadas con los electrones
  involucrados en procesos redox
• Potenciométricos Usan electrodos selectivos para
  ciertos iones
• Conductimétricos Determinan cambios en la
  conductancia asociados con cambios en el
  ambiente iónico de las soluciones
• BIOSENSORES TERMOMÉTRICOS
• BIOSENSORES PIEZOELÉCTRICOS
• BIOSENSORES ÓPTICOS
• De onda envanescente
• Resonancia de plasma superficial
• BIOSENSORES CELULARES
• INMUNOSENSORES

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UNIDADES FUNCIONALESDE UN BIOSENSOR
17
(No Transcript)
18
Cinéticas de reacción en biosensores
19
Biosensores Electroquímicos Amperométricoselectro
do de oxígeno
20
Biosensores Electroquímicos Amperométricoselectro
do de oxígeno

• Reacciones redox catalizadas por enzimas
• Voltaje constante entre dos electrodos
• Corriente debida a la reacción de los electrodos

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Electrodo de Oxígeno
En este principio se basa el primer y más
sencillo biosensor Determinación de
glucosa Electrodo de oxígeno de Clark
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Electrodo de Oxígeno
(A) Disco de resina epoxy (B) Cátodo de platino
en el centro de un saliente. (C) Ánodo de plata
en forma circular (D) Anillo de goma que sostiene
un papel espaciador empapado en un electrolito y
una membrana de polytetrafluoroethylene que
separa los electrodos de la mezcla de reacción.
23
DETERMINACIÓN DE GLUCOSA
La glucosa se determina por la disminución de la
concentración de oxígeno molecular disuelto
cuando la glucosa oxidasa cataliza la reacción
redox
24
DETERMINACIÓN DE GLUCOSA
Entre el cátodo central de platino y el ánodo
circundante de plata se aplica un potencial de
0.6 voltios. El circuito se cierra con solución
saturada de KCl. El oxígeno molecular disuelto se
reduce en el cátodo de platino. Se liberan
electrones y se produce corriente eléctrica que
se puede medir.
P
u
e
n
t
e

d
e

K
C
l
-
4
e
-



0
,
6
-
0
,
7
v
25
DETERMINACIÓN DE SACAROSA
flujo
26
DETERMINACION DELA FRESCURA DEL PESCADO
27
DETERMINACION DELA FRESCURA DEL PESCADO
Tras la muerte, los nucleótidos del pescado
sufren una serie de reacciones de degradación
progresiva
ATP gt ADP gt AMP gt IMP gt HxR gt Hx gt Xantina gt
Acido úrico
La acumulación de inosina e hipoxantina respecto
de los nucleótidos es un indicador del tiempo que
hace que el pez murió y de sus condiciones de
conservación, por tanto, de su frescura.
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DETERMINACION DELA FRESCURA DEL PESCADO
BIOSENSOR xantina-oxidasa y nucleósido-fosforil
asa inmovilizadas sobre una membrana de
triacilcelulosa de un electrodo de oxígeno
K lt 20 El pescado puede ser comido
crudo 20 gt K lt 40 El pescado debe ser cocinado K
gt 40 Pescado no apto para el consumo
Los nucleótidos se podrían determinar utilizando
el mismo electrodo y muestra, pero añadiendo
nucleotidasa y adenosín-deaminasa
29
DETERMINACION DELA FRESCURA DEL PESCADO
ATP gt ADP gt AMP gt IMP gt HxR gt Hx gt Xantina gt
Acido úrico
Ensayo simple para determinar de forma segura y
fiable la frescura del pescado, que tiene gran
importancia para la industria. La determinación
de frescura en las inspecciones sería
completamente subjetiva.
30
Biosensores Electroquímicos Amperométricos
Ventaja Fáciles de fabricar. Desventajas Reacci
ón dependiente de concentración de oxígeno.
Ambientes anaerobios. Otros procesos redox.
Oxidación/reducción de vitamina C.
Interferencia. Sustitución del oxígeno por otras
sustancias.
31
La reacción mediada por el biosensor está
compuesta por tres procesos redox
32
Mecanismos redox para diferentes configuraciones
de biosensores amperométricos
33
Mediadores redox en biosensores amperométricos
Oxidasas más especfíicas para el reactivo a
oxidar Rápidas velocidades de transferencia de
electrones Capacidad para ser regenerados
fácilmente Retenibles en membrana
biocatalítica No reaccionar con otras moléculas,
incluyendo oxígeno molecular
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Mediadores redox en biosensores amperométricos
Tetracianoquinodimetano aceptor parcial de
electrones Ferroceno, tetratiofulvaleno y N-metil
fenazinio donantes parciales de
electrones Hidroquinona y ferrocianuro mediadores
solubles
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Biosensor que detecta concentración de glucosa en
sangre. Construido y vendido para el control de
los enfermos diabéticos.
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Área de detección dispositivo con electrodo de un
solo uso Deposición sobre una tira de plástico.
Consta de electrodo de referencia Ag/AgCl y
electrodo de carbono con glucosa oxidasa y
mediador de ferroceno Ambos electrodos cubiertos
con tejido hidrofílico. Paso de moléculas de
diferente tamaño, difusión homogenea, evita
evaporación desigual Duración 6 meses Detección
2-25 mM en una gota de sangre Resultado en 30
segundos
37
Miniaturización
Posible por la capacidad del pirrol para
polimerizar mediante oxidaciones electroquímicas
en condiciones suficientemente suaves como para
atrapar enzimas y mediadores sin desnaturalizarlos
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Microelectrodo glucosa/lactato
Se puede recubrir la superficie de pequeños
electrodos polimerizando pirroles junto con
biocatalizadores y mediadores, utilizando métodos
de microfabricación de microprocesadores, e
incluso disponiendo varios sensores en los mismos
39
Biosensores Electroquímicos Potenciométricos

• Determinan cambios en la concentración de iones
  concretos

40
Biosensores Electroquímicos Potenciométricos

• Usan electrodos selectivos para ciertos iones
• Electrodos ion-selectivos. pHmetro
• Baratos
• Determinación de varios analitos
• Mayor velocidad
• Muy poca muestra
• Necesidad de compensación de la temperatura

41
Biosensores Potenciométricos
42
Biosensor Potenciométrico
43
Biosensores Electroquímicos Conductimétricos

• Detectan cambios en conductividad eléctrica
  causados por alteraciones en la concentración de
  iones

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Biosensores Electroquímicos Conductimétricos

• En muchos procesos biológicos se producen cambios
  en concentraciones iónicas
• Estos cambios pueden ser usados por biosensores
  que detecten cambios en la conductividad eléctrica

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Sensor de Urea
Ureasa inmovilizada Cirugía renal y
diálisis Reacción provoca gran cambio en
concentración iónica
46
Sensor de Urea
Un campo alternante entre dos electrodos permite
la determinación de los cambios en conductividad,
evitando procesos electroquímicos no
deseados Electrodos dispuestos para ocupar mínimo
espacio 0.1 y 10 mM de urea
47
Sensor de Urea
Otros ejemplos amidasas, decarboxilasas, esterasa
s, fosfatasas y nucleasas.
48
Biosensores TermométricosSensores bioquímicos
y TELISA

• La producción de calor es una propiedad general
  de muchas reacciones enzimáticas
• Base de los biosensores calorimétricos o térmicos

49
Biosensor termométrico
50
Biosensor termométrico
Los cambios ambientales no afectan a los cambios
de temperatura detectados Reacción confinada en
dispositivos termoaislados (a) Precisa un
aislamiento correcto La corriente del analito
pasa a través de un intercambiador de calor (b)
51
Biosensor termométrico
La reacción tiene lugar en un pequeño reactor
(c) La diferencia en temperatura del analito que
entra y el producto que sale es determinada por
los termistores interconectados (d) Diferencia
habitual de una fracción de grado
centígrado Diferencias de hasta 0.0001ºC
52
Reacciones usadas en biosensores termométricos
53
Biosensores Termométricos
Poco éxito comercial en comparación con otros
biosensores Ventajas Se puede acoplar fácilmente
varias reacciones en un único reactor Producir
reacciones que actúan sobre los productos de la
reacción principal Coinmovilizando otras
enzimas Introduciendo más reactivos en la
corriente a analizar
54
Biosensores Termométricos
Detector de Lactato La sensibilidad a lactato se
incrementa por coinmovilización de lactato
deshidrogenasa con lactato oxidasa Reciclaje de
productos de la primera reacción del sustrato

lactato oxidasa lactato O2
-----------------------gt piruvato H2O
lactato deshidrogenasa piruvato NADH
H --------------------------gt lactato NAD
55
Biosensores Termométricos
Más ventajas Puede utilizarse células
viables Uso de células viables inmovilizadas en
un reactor, no sólo para producir
bioconversiones, sino para controlar la presencia
de un sustrato metabolizable en la corriente a
analizar Análisis de la presencia de materiales
tóxicos en una muestra, ya que afecta la tasa
metabólica de las células inmovilizadas sobre un
determinado sustrato
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Biosensores Termométricos
Más ventajas Puede acoplarse a un inmunoensayo
enzimático ELISA termométrico o TELISA Mezcla
antígeno no marcado (analito) y antígeno marcado
enzimáticamente en concentraciones conocidas
junto con un reactor en el que se ha depositado
una capa de inmunoadsorbente Aumento en cantidad
de antígeno no marcado desplaza al antígeno
marcado de la unión a la capa del reactor por
competición La cantidad de antígeno marcado que
queda en el reactor se puede determinar por
adición a la corriente que pasa por él del
sustrato de la enzima que marca el antígeno y
midiendo la cantidad de calor en la reacción
enzimática
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Biosensores PiezoeléctricosNarices
bioelectrónicas
58
Biosensor de fibra óptica para lactato

• Detecta cambios en la en la concentración de
  oxígeno determinando la reducción de la
  fluorescencia de un fluorocromo (quenching)

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Biosensor de célula óptica para albúmina sérica

• Detecta la absorción de luz a 630 nm que pasa a
  través de la célula detectora.
• Se evalúa el cambio de amarillo a azul verdoso
  del verde de bromocresol cuando se une a la
  albúmina sérica a pH 3.8
• Respuesta lineal a la albúmina en un intervalo de
  5 a 35 mg/cm3

60
Biosensores Ópticos

• Detección de Vapores
• Ensayo sólido colorimétrico que detecta vapor de
  alcohol utilizando alcohol-oxidasa, peroxidasa y
  2,6-diclorindofenol sólidos dispersados sobre
  placas de TLC (cromatografía en capa fina) de
  celulosa microcristalina transparente.
• Tiras colorimétricas de un solo uso
• Los más utilizados análisis de sangre y orina.
• Control de la glucemia en diabéticos
• Glucosa oxidasa, peroxidasa de rábano y un
  cromógeno que cambia el color al ser oxidado
• Cromógeno (2H) H2O2----(peroxidasa)---gtcolorante
  2H2O

61
Biosensores Ópticos

• 3) Reacciones luminiscentes
• Utilización de luciferasa
• Detecta la presencia de microorganismos en orina
  al liberar ATP en su destrucción
• Luciferina ATP----(luciferasa)---gt
  oxiluciferina CO2 AMP ppi luz

62
Biosensores ÓpticosOnda evanescente

• Se basa en un fenómeno conocido como reflexión
  interna total de fluorescencia, que consiste en
  la absorción y emisión de fotones.

63
Biosensores ÓpticosOnda evanescente

• En este sensor una radiación que viaja a través
  de una guía de ondas por reflexión interna total
  crea un campo electromagnético denominado campo
  evanescente, que puede penetrar una determinada
  distancia desde la superficie dependiendo del
  ángulo de incidencia en la interfase y la
  longitud de onda de la radiación de excitación.

64
Biosensores ÓpticosOnda evanescente

• Cualquier interacción molecular que se produzca
  en este campo (como la unión de un analito a un
  receptor inmovilizado en la superficie de la guía
  de ondas) produce cambios en las características
  de la luz que se propaga por la guía de ondas que
  pueden medirse y relacionarse con la
  concentración de analito.

65
Biosensores ÓpticosOnda evanescente

• Es necesario utilizar marcaje con moléculas con
  propiedades fluorescentes.
• Permite una detección directa, rápida y selectiva
  del analito.

66
Biosensores ópticos de onda evanescente
Un haz de luz será reflejado en su totalidad
cuando incida sobre una superficie transparente
presente entre dos medios, cuando proceda del
medio con mayor índice de refracción y cuando el
ángulo de incidencia sea mayor que un valor
critico
67
Biosensores ópticos de onda evanescente
En el punto donde se produce la reflexión, se
induce un campo electromagnético que penetra en
el medio que tiene menor índice de
refracción Este campo es denominado onda
evanescente y decae exponencialmente con la
distancia de penetración, desapareciendo tras
unos pocos nanómetros
68
Biosensores ópticos de onda evanescente
La onda evanescente decae exponencialmente con
la distancia de penetración, desapareciendo tras
unos pocos nanómetros La profundidad a la que
penetra depende del índice de refracción, de la
longitud de onda de la luz utilizada y puede ser
controlada con el ángulo de incidencia.
69
Biosensores ópticos de onda evanescente
La onda evanescente puede interaccionar a su vez
con el medio, provocando un campo
electromagnético que puede volver al medio con
mayor índice de refracción, dando lugar a cambios
en la luz que continúa a lo largo de la guía de
ondas.
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Inmunosensor de onda evanescente

• Especialmente indicados para inmunoensayos
• No es necesario separar el resto de los
  componentes de una muestra clínica
• La onda solo penetra hasta el complejo antígeno
  anticuerpo
• Se excitan fluorocromos unidos a la superficie
  mediante la onda evanescente, y la luz emitida
  por ellos volverá a la fibra óptica
• La cantidad de muestra necesaria es mínima

71
Biosensores ÓpticosResonancia de plasmones
superficiales

• Los plasmones son oscilaciones colectivas de los
  electrones de conducción de un metal.
• La resonancia de plasmones superficiales es un
  fenómeno óptico que ocurre cuando una luz
  polarizada se dirige desde una capa de mayor
  índice de refracción (un prisma) hacia una de
  menor índice de refracción, que en este caso es
  una capa metálica, de oro o de plata, que se
  sitúa entre el prisma y la muestra.

72
Biosensores ÓpticosResonancia de plasmones
superficiales

• La luz que incide en la interfase entre el metal
  y el prisma provoca la excitación de un plasmón
  superficial para un determinado ángulo de
  incidencia de dicha luz, llamado ángulo de
  resonancia.

73
Biosensores ÓpticosResonancia de plasmones
superficiales

• El ángulo de resonancia depende fuertemente del
  índice de refracción del medio colindante a la
  lámina metálica, por lo que las variaciones que
  se produzcan en el mismo van a ser detectadas
  como cambios del ángulo de resonancia y este
  cambio es proporcional a la concentración.

74
Biosensores ÓpticosResonancia de plasmones
superficiales

• La unión de los analitos al elemento de
  reconocimiento supone un cambio de índice de
  refracción sobre la superficie del metal y, como
  consecuencia, un desplazamiento del ángulo de
  resonancia.

75
Biosensores ÓpticosResonancia de plasmones
superficiales

• Esto permite realizar medidas directas en tiempo
  real, sin marcaje, así como el análisis de
  muestras complejas sin purificación previa.

76
Resonancia de plasma superficial
Si la superficie del cristal está recubierta por
una capa metálica (oro, plata, paladio) los
electrones de su superficie pueden oscilar en
resonancia con los fotones generando un onda de
plasma superficial y amplificando el campo
evanescente en la cara mas alejada del metal
77
Resonancia de plasma superficial
Si la capa de metal es lo suficientemente
delgada como para permitir al campo evanescente
penetrar hasta la superficie opuesta, el efecto
será muy dependiente del medio adyacente al metal
78
Resonancia de plasma superficial
Este fenómeno sucede sólo cuando la luz incide
con un ángulo específico, el cual depende de la
frecuencia, el grosor de la capa metálica y el
índice de refracción del medio que se encuentra
inmediatamente sobre la superficie metálica
79
Resonancia de plasma superficial
La producción de esta resonancia de plasma
superficial absorbe parte de la energía de la luz
reduciendo la intensidad de la luz reflejada
internamente
80
Resonancia de plasma superficial
Los cambios que suceden en el medio provocados
por interacciones biológicas pueden ser
apreciados detectando los cambios de intensidad
de la luz reflejada o el ángulo de resonancia
81
Cambio en la absorción por efecto de la
resonancia de plasma superficial
Detección de la gonadotropina coriónica humana
(hCG) mediante un anticuerpo unido a la
superficie del biosensor La unión causa un
cambio en el ángulo de resonancia
82
Resonancia de plasma superficial

• Permiten detectar partes por millón
• Un análisis típico requiere 50µl de muestra y
  tarda 5 a 10 minutos
• Puede utilizarse con DNA y RNA.

83
(No Transcript)
84
Biosensores celulares

• Las células microbianas, como biocatalizadores,
  poseen ciertas ventajas sobre las enzimas
  purificadas cuando se usan en biosensores
• Baratos
• Vida media más larga
• Menos sensibles a inhibición, al pH y a
  temperatura
• Capacidad autorregenerativa

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Biosensores celulares

• Desventajas
• Más lentos en respuesta
• Más lentos en velocidad de recuperación
• Menor selectividad
• Fácilmente disgregables
• Condiciones más suaves

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Biosensores celulares

• Muy útiles cuando se requieren varios pasos o la
  presencia de coenzimas
• Células vivas o muertas

87
Biosensores celulares
88
Inmunosensores
89
Tipos de inmunosensores
90
(No Transcript)
91
(No Transcript)
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Nanobiosensores en el Campo de la Medicina
Nanobiosensores en urgencias
Nanobiosensores en la consulta