Analiza danych pochodzacych z mikromacierzy DNA

1
Analiza danych pochodzacych z mikromacierzy DNA

• Agnieszka Ludwików
• Jan Sadowski
• Uniwersytet im. Adama Mickiewicza
• ludwika_at_amu.edu.pl

2
Etapy eksperymentu microarray

• Dlaczego?

Planowanie eksperymentu microarray
Eksperyment
Analiza danych
Interpretacja danych
Weryfikacja danych
3
Zastosowanie mikromacierzy DNA

• Profilowanie ekspresji genów
• Wykrywanie mutacji (SNP)
• Genotypowanie
• Szacowanie liczby kopii (CGH)
• Mapowanie genów i klonów

4
Problemy?

• Opis genów bazy danych
• Krzyzowa hybrydyzacja
• (rodziny genowe)
• Niepowtarzalnosc warunków eksperymentu
• (warunki hodowli, wyposazenie uzyte do
  eksperymentu)
• Material biologiczny
• (ilosc, jakosc)

5
Planowanie eksperymentu

• Mikromacierze
• GeneChip Affymetrix
• cDNA, oligo na szkielkach
• Makromacierze
• - cDNA nylony

6
GeneChip Affymetrix

• kazdy gen reprezentowany jest przez 11- 20 par
  25-merów.
• Pary PM i MM (pomiar tla i niespecyficznej
  hybrydyzacji)

7
Eksperyment microarray
Zródlo zmiennosci

• Procedura
• (izolacja RNA, znakowanie, hybrydyzacja,
  skanowanie)
• Replikacje techniczne i biologiczne
• (zmiennosc biologiczna)

8
Replikacje techniczne
1
2
3
1
2
3
9
Replikacje biologiczne
Ile replikacji?

• Zyskujemy zmiennosc biologiczna, która
  reprezentuje populacje !
• ALE
• Tracimy zmiennosc osobnicza

Peng X. i inni, 2003, BMC Bioinformatics 2003,
426 Bakay M. i inni, 2002, BMC Bioinformatics
2002, 34
10
Analiza danych

• Analizy jakosciowe
• dCHIP detekcja chipów poza norma (outlier
  detection) oraz
• PCA (Analiza komponentów glównych)

11
Analiza danych

• Normalizacja
• To minimize non-biological variation and focus
  on real biological changes
• dCHIP http//www.dchip.org/
• Li Ch. Wong W.H., 2001, Proc. Natl. Acad.
  Sci. Vol. 98, 31-36.
• Zhong S., 2003, Nucleic Acids Research. Vol.
  31, 3483-3486.
• RMAExpress http//www.bioconductor.org/
• Bolstad B.M. i inni, 2003, Bioinformatics
  19(2)185-193
• Irizarry R.A., i inni, 2003, Nucleic Acids
  Research 31(4)e15
• Genespring http//www.silicongenetix.com

12
Analiza danych
ID Kontrola1 Kontrola2 Kontrola3 ozonowana1 ozonowana2 ozonowana3
267454_at 928,9 953,7 870,2 92,82 97,82 95,82
267461_at 83,3 113,6 54,6 173,5 189,5 199,5
267435_at 95,7 92,8 85,7 144,6 176,6 132,6
267411_at 50,65 52,00 52,00 520,9 495,9 465,9

• Otrzymujemy liste genów, których poziom
  transkrypcji spada lub rosnie
• Czy i na ile wykryta zmiana jest rzeczywista?

13
Analiza danych
ID Kontrola1 Kontrola2 Kontrola3 ozonowana1 ozonowana2 ozonowana3
267454_at 928,9 953,7 870,2 92,82 97,82 95,82
267461_at 83,3 113,6 54,6 173,5 189,5 199,5
267435_at 95,7 92,8 85,7 144,6 176,6 132,6
267411_at 50,65 52,00 52,00 520,9 495,9 465,9
P-value
4,45E-05
5,68E-06
4,89E-04
4,80E-05

• Uzyj metod statystycznych do oszacowania
  istotnosci uzyskanych zmian.
• UWAGA 2 typy bledów tzw. False positives
  False negatives
• Uzyj parametru krotnosci zmian (Fold change) by
  oszacowac zróznicowanie profili. 2 krotna
  represja lub indukcja jest powtarzalna przez
  analizy ilosciowe
• UWAGA Zazwyczaj wyzsze krotnosci zmian
  wykazuja geny o niskim poziomie transkrypcji
• Geny, które zmieniaja poziom transkrypcji z
  zadanym statystycznym prawdopodobienstwem
  (P-VALUE) i z zadana krotnoscia zmian!!!

14
Analiza danych

• Poszukiwanie zwiazku miedzy poziomem transkryptu
  a sekwencja genu, jego funkcja, szlakiem
  sygnalowym, szlakiem metabolicznym etc.
• Geny kodujace bialka uczestniczace w tym samym
  procesie lub sa czescia tego sameo kompleksu
  najczesciej sa koregulowane.
• Klastery genów spelniajacych podobne funkcje
  czesto wykazuja skorelowany profil transkrypcji w
  warunkach róznych stresów, warunków srodowiska
  etc.
• Typy klusterów Hierarchiczne, Self Organizing
  Maps (SOM), K-mean
• Poszukiwanie cis-sekwencji u koregulujacych sie
  genów
• AGRIS http//arabidopsis.med.ohio-state.edu/
• PlantProm DB http//www.softberry.com/berry.phtml
  
• PlantCare http//oberon.fvms.ugent.be8080/PlantC
  ARE/index.html
• Place http//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/
• Transfac http//www.gene-regulation.com/pub/datab
  ases.htmltransfac
• MEME http//meme.sdsc.edu/meme/website/intro.html
  
• MotifSampler http//www.esat.kuleuven.ac.be/thi
  js/Work/MotifSampler.html

15
Weryfikacja danych
Microarray nie jest technika ilosciowa Poziom
intensywnosci sygnalu wzglednie swiadczy o
poziomie transkryptu.
Analizy ilosciowe relative quantification - gen
referencyjny np. aktyna2, 18S rRNA

• Northern
• Taniguchi M. i inni, 2001, Genomics. Jan
  171(1)34-9.
• ilosciowy Real time RT-PCR
• Tricarico C. i inni, 2002, Analytical
  Biochemistry 309 (2002) 293300
• Jenson S.D. i inni, 2003, J Clin Pathol Mol
  Pathol56307312
• http//info.med.yale.edu/wmkeck/affymetrix/rtpcr/

16
Roslinne bazy danych microarray

• The Nottingham Arabidopsis Stock Centre's (NASC)
• 
  http//arabidopsis.info/
• Stress Genomics Consortium http//www.osmid.org/
  
• http//www.stress-genomics.org
• The Arabidopsis Functional Genomics Consortium
  (AFGC)
• Stanford Microarray Database (SMD)
  http//www.arabidopsis.org
• Soybean genomics and microarray database (SGMD)
  http//psi081.ba.ars.usda.gov
• Complete Arabidopsis Transcriptome MicroArray
  database (CATMA)
• http//www.catma.org/
• Tomato Expression Database (TED)
  http//ted.bti.cornell.edu/
• http//sgn.cornell.edu/
• Plant-Arrays database
• http//www.univ-montp2.fr/plant_arrays/databa
  ses.html