DNA REKOMBINAN

1
DNA REKOMBINAN

• Pengenalan DNA rekombinan
• Pengenalan kepada metodologi DNA rekombinan
• Kegunaan kejuruteraan genetik

2
PENGENALAN

• DNA rekombinan adalah penyambungan semula molekul
  DNA
• Hasil daripada teknologi pengklonan
• Teknik yang terlibat disebut sebagai
  penjuruteraan genetik

3
METODOLOGI DNA REKOMBINAN
Penghibridan (Hybridisation)
Oligonukleotida sintetik
DNA rekombinan
Penjujukan (Sequencing)
Pengklonan (Cloning)
PCR
Pencernaan DNA (DNA digest)
4
Penghibridan

• Penetapan DNA ke membran nilon atau nitroselulosa
  
• Penambahan prob bertanda radioaktif/ enzim yang
  akan menghibrid kepada jujukan DNA yang diminati
• Pengenalpastian DNA yang diminati pada DNA
  rekombinan/klon
• Rajah 10.8

5
Penjujukan

• Penentuan jujukan nukleotida bagi fragmen DNA,
  DNA rekombinan yang terhasil, gen atau kromosom
• kaedah degradasi kimia ( Maxam dan Gilbert (1977)
  -Rajah 5-3
• Kaedah berenzim Sanger et al. (1977)-
• Rajah 5-4
• Terkini ?kaedah berautomasi

6
Output of a DNA sequence from an automated
sequencer
7
PCR

• Penghasilan/amplifikasi fragmen DNA sasaran
  secara berganda (eksponen) 2n- 230- 268,435,456
  molekul dsDNA
• Langkah-langkah dibawah diulang sehingga 30-40
  kali
• -Denaturasi 94o C
• -Penyepuhan 45-72o C
• -Pemanjangan 72o C
• Rajah 10.11

8
PCR

• Komponen yang perlu
• Templat DNA (sedikit)
• Pencetus (perlu tahu jujukan)
• Enzim polimerase stabil haba (Taq polimerase)
• dNTP
• Mg
• Alat kitar terma

9
PCR- Alat kitar terma
10
Pencernaan DNA

• Penglibatan enzim penyekat dalam memotong DNA
  kepada fragmen yang tertentu
• Mengenal jujukan 4-8 bp yang spesifik (palindrom)
• Memotong DNA dwiheliks dengan spesifik
• Fungsi semula jadi memusnahkan DNA asing yang
  masuk dalam bakteria

11
Enzim Penyekat
EcoRI dari E.coli
G A A T T C
C T T A A G
A A T T C
G
G
C T T A A
Hujung melekit
12
Tindakan Enzim Penyekat
Jujukan PALINDROM
G A A T T C
EcoRI dari E.coli
C T T A A G
A A G C T T Hind III dari T T C G A A
Haemophilus influenza
13
(No Transcript)
14
Pengklonan

• Empat proses terlibat (Rajah 10.2)
• 1) Pemotongan vektor dan fragmen DNA yang
  mengandungi gen yang diminati dengan enzim
  penyekat
• 2) Penyambungan vektor dan fragmen DNA yang
  mengandungi gen yang diminati bagi membentuk DNA
  rekombinan (DNA ligase)

15

• Enzim Penyambung - DNA Ligase
• Membentuk ikatan fosfodiester
• Tindakan DNA ligase berlawanan dengan tindakan
  enzim penyekat
• perlu ATP dan 5 fosfat dan 3 hidroksil
• Boleh menyambung DNA berhujung melekit atau
  berhujung tumpul
• Lebih efisien menyambung DNA berhujung melekit

OH (P)
OH
P
ATP Ligase
5-AATCGATCGTCC- -TTAGCTAGCAGG-5
5-AATCGATCGTCC- -TTAGCTAGCAGG-5
P
OH
- Enzim DNA ligase tidak perlu jujukan spesifik
16
Pengklonan

• Empat proses terlibat (sambungan)
• 3) Memasukkan ke dalam hos iaitu pembawa yang
  akan mereplikasi DNA rekombinan (transformasi)
• 4) Mengenalpasti klon yang membawa DNA rekombinan
  (hibridisasi/pencernaan dengan enzim penyekat)
• Contoh vektor pengklonan (Rajah 10.4 dan 10.9)

17
(No Transcript)
18
Oligonukleotida sintetik

• DNA bebenang tunggal yang disintesis dalam makmal
  (Rajah 10.10)
• Jujukan DNA ditentukan oleh penyelidik mengikut
  keperluan ujikaji
• digunakan sebagai -
• - prob (penanda) dalam penghibridan
• - primer dalam PCR
• - proses mutagenesis terarah tapak
• (Rajah 10.15)

19
KEGUNAAN KEJURUTERAAN GENETIK

• Kesihatan manusia pelbagai produk kesihatan
• Pertanian dan penternakan Tumbuhan dan haiwan
  transgenik
• Bioteknologi persekitaran degradasi pencemar
• Forensik
• Bioteknologi industri

20
Bahan terapi yang terhasil daripada teknologi DNA
rekombinan

• Protein darah,Hormon manusia, Pengatur imun,
  Vaksin (Jadual 10.1)
• Terapi genpenghantar dadah, ganti gen cacat
  (Sistik fibrosis,Duchenne Muscular Dystrophy,
  Adenosine deaminase , Hemophilia, Thalassemia,
  Kanser
• pengaturan gen RNA Anti-erti

21
(No Transcript)
22
Pertanian

• Penghasilan tumbuhan transgenik menggunakan
  Agrobacterium tumefaciens (Rajah 10.19)
• Kelebihan tumbuhan transgenik
• Buah lambat masak/rosak
• Tumbuhan rintang penyakit
• Tumbuhan rintang racun rumpai

23
Tomato- Flavr savr Teknologi Anti-erti
Buah Lambat masak
24
(No Transcript)
25
Bioteknologi persekitaran

• Menyahtoksik logam berat
• Tukar ke molekul tidak toksik e.g. CuS04 dan
  PbSO4
• Lombong dan kawasan tercemar
• Kawasan perawatan bahan buangan
• -Nyahtoksik bahan organik

26
Bioteknologi industri

• Enzim
• Proses membuat minuman/makanan
• Detergen (protease)
• Perasa, pewarna
• Asid organik
• Asid amino
• Vitamin

27
Teknologi Forensik

• Darah atau tisu Perlu segar (sebaik-baiknya) Ti
  dak unikDNA Unik, lebih pasti Analisis RFLP
  dan pemblotan southern Banding DNA suspek dan
  mangsa Guna enzim penyekat dan
  elektroforesisPCR membanyakkan salinan DNA

28
Teknologi Forensik

• -pencapjarian DNA- jenayah, kemalangan, waris
  -Guna DNA berulang -mikrosatelit/short tandem
  repeat

29
Teknologi Forensik
30
Teknologi Forensik

31
Ringkasan proses yang terlibat dalam kejuruteraan
genetik

• Teknik-teknik yang disebutkan sebelum ini adalah
  saling berkaitan antara satu sama lain
• Rajah 10.23

32
(No Transcript)
33
DNA, gen kromosom