Endometriosiz, inflamasyon ve hormon resept

1
Endometriosiz, inflamasyon ve hormon reseptörleri

• Orhan Bukulmez, M.D.
• Associate Professor and Division Director
• Division of Reproductive Endocrinology
  Infertility
• Practice Medical Director IVF program
• Department of Obstetrics and Gynecology
• University of Texas Southwestern Medical Center
• Dallas, Texas

2
TIME Feb. 23, 2004
3
Inflamasyon birçok hastaligin patogenezinde
önemli rol oynar
Cancer
Pulmonary diseases
Cardiovascular diseases
Inflammation
Alzheimers disease
Neurological diseases
Autoimmune diseases
Diabetes II
Arthritis
4
(NF)-kB/Rel Transkripsiyon faktörleri c-Rel
NF-kB1 (p50 ve bunun ön bilesigi
p105) NF-kB2 (p52 ve bunun ön bilesigi
p100) p65 (RelA) RelB Klasik NF-kB
kompleksi Heterodimer p65/RelA and p50
subüniteleri, hücrelerde inhibitor proteinlere
bagli olarak bulunur IkBs. En bilineni IkBa
olup NF-kB yi sitoplazmada tutup nükleer
lokalizasyon dizilimini maskelemek ve de NF-kB
proteinlerinin nükleusdan uzaklastirilmasinda rol
oynar. Regüle ettigi fonksiyonlar
Proliferasyon Differensiasyon Programli
hücre ölümü (Apoptoz) Tümörigenez T ve B hücre
proliferasyonu ve gelisimi Inflamasyon Master
Regülatör Inflamasyon Immunite
5
NF-kB
p65
p50
IkBa
Activator
Ubiquitination Phosphorylation IKK?
Nuclear import
p50
p65
p50
p65
IkBa
kB enhancer
Degradation
IkBa
Cytoplasm
Nucleus
Garg and Aggarwal, Leukemia, 2002
6
NF-kB Aktivatörleri
ROS inducers (H2O2, free iron, heme)
Carcinogens (e.g TNF, CSC, DMBA)
Cytokines (TNF family, IL-1, IL-17, IL-18, EGF)
NF-kB
Tumor Promoters (PMA)
Infection (bacterial/viral e.g HIV, EBV-LMP,
HTLV1, via TLRs)
Stress (pH, hypoxia,stress heavy metals)
Apoptosis-inducers Chemotherapeutic agents
g-irradiation
Endotoxin (LPS)
Aggarwal BB, Cancer Cell, 2004
7
Anormal NF-kB aktivasyonu gösteren majör
hastaliklar

• Kalp yetmezligi iskemik reperfüzyon hasari
  Kardiak hipertrofi
• Multiple sclerosis
• Muscular dystrophy
• Alzheimers
• Inkontinentia pigmenti
• Ektodermal displazi
• Systemic inflammatory response syndrome Septik
  sok
• Inflammatory bowel disease Ülseratif kolit,
  Crohns
• Renal hastaliklar
• Neuropatolojiler
• H.Pylori gastriti
• Kanser, artrit, AIDS, astim, DM, Yaslanma, Viral
  infeksiyonlar, Uyku apnesi, KOAH, Lupus,
  ENDOMETRIOSIZ

Kumar A, Takada Y, Boriek AM, Aggarwal BB.
Journal of Molecular Medicine
200482434-48 Gonzalez-Ramos R et al Fertil
Steril 201298520-528
8
NF-?Bnin regule ettigi genler ve Endometriozis

• Sitokinler (TNF?, IL-1, IL-6, vs)
• Kemokinler (IL-8, macrophage inflammatory
  protein (MIP)-1?, monocyte chemotactic protein 1
  (MCP1), regulated upon activation normal T cell
  expressed and secreted (RANTES), eotaxin)
  Periton sivisinda endometrioizde artan düzeyler.
• Adhezyon molekülleri (E-selectin, vascular cell
  adhesion molecule 1 (VCAM-1) and intercellular
  cell adhesion molecule 1 (ICAM-1)
• Inducible enzymes (eg. COX-2, iNOS, caspases,
  MMP9)
• Cellular inhibitor of apoptosis protein (c-IAP1
  2), TNF-receptor-associated factors (TRAFs),
  B-cell lymphocyte-leukemia-2 (Bcl-2) homologs
  (A1/BFl-1, IEX-IL), Fas, c-myc and cyclin D1.
• NF-kB ayrica TLRs, TNF? and IL-1ß, tarafindan
  da aktive edilir pozitif oto-regulator siklus
  Bir kere tetiklendiginde inflamasyon gittikçe
  amplifiye olur ve iltihap cevabinin siddeti artar
  ve de süresi uzar.

Chen. Nat Rev Mol Cell Biol 20045392. Ghosh S
et al. Annu Rev Immunol 199816225. Karin M.
Annu Rev Immunol 200018621-63. Tam WF. Mol
Cell Biol 2000202269.Ghosh S. Cell
2002109SS81. Khan KN et al. Gynecol Obstet
Invest 20096840-52.
9
NR4A öksüz (orphan) nükleer reseptörler

• Büyüme faktörleri ekspresyonunda rol oynayan
  erken cevap genlerindendir (sinir büyüme faktör
  aktivasyonu)
• Inflamasyona neden olan faktörlere çok hizli
  cevap verir.
• NF-kB ekspresyonlarini artirir. Ekspresyon
  aktivasyonla korele
• Nur77
• Nurr1
• NOR1
• Nurr1 Timus, osteoblastlar, karaciger, pituiter
  bez
• Nor1Pituiter bez, timus, böbrek, kalp, iskelet
  kasi, adrenal
• Nur77 çogu hücre sisteminde bulunur Ekpresyonu
  NF-kB aktivasyonu ile koreledir
• Nur77 digerlerine kiyasla endometriyum ve
  endometriosizde saptanabilen yegane NR4A grubu
  reseptördür
• NFkB aktivasyonunun dogrudan olmayan bir
  göstergesidir

Pei et al J Biol Chem 200529256 Suzuki et al
PNAS 2003100(14)8276 Harant Lindley Nuc Acid
Res 2004325280
10
Estrogen receptor (ER)

• ER 1986 (ERa)
• ERb 1996
• 17b-E2 her ikisine de esit duzeyde baglanir (ERa
  ERb)
• ERb yaygin olarak bulunsa da uterus çok yüksek
  bir ekspresyon göstermez.
• Prostat, tükrük bezleri, testis, over, vasküler
  endotel, düz kas, bazi nöronlar, bagisiklik
  sistem hücreleri

Harris Mol Endocrinol 2006
11
ERb

• ERa agonist proliferation
• E2 Cell line no effect
• (HC11) ERb agonist proliferation
• (lact.mammary gl)

Faulds et al. Mol Endocrinol 200418412421
Expressed in developing uterus, switching to ERa
when completed Keeps uterus quiescent before
ovary secretes E2 (3bAdiol) Cervical ripening,
decidualization in adult uterus Lost in
endometrial cancer Plays important role in
elastic recoil of uterus blockadeprolapse Highly
expressed in granulosa cells No consensus bERKO
mice phenotype
Koehler et al Endocr Rev 200526465 Paul et al
Cancer Invest 200422211
12
Structural domains of the human ERa and ERb
Koehler, K. F. et al. Endocr Rev 200526465-478
13
ERb nin hayvan modelleri üzerine etkileri

• Non-selektif estrogenler NF-kB aktivasyonuna bazi
  sistemlerde engel olabilir
• Estrojenin bu tür anti-inflamatuvar ERb üzerinden
  olabilir
• ERb selektif agonistler fare inflamatuvar artrit
  modelinde yarali bulunmustur
• Yine IBH (UC gibi) modelinde etkilidir
• Travma-kanama modelinde akciger hasarini IL-6,
  iNOS, LDH yi düsürerek azaltir
• MI sepsis modellerinde yararli (survivali
  artiriyor)
• ERb -/- mice myeloproliferative disease
• ERa -/- mice autoimmune disease (GN)

14
ERb

• Regulasyonu?
• gt10 izoform
• E2 verilen saglikli siçanlarda ERb ya bagimli
  genler gösterilememistir
• Sadece hayvan strese maruz kaldiginda ya da
  hastalandiginda fonksiyonlari önem kazanabilir.
• Challenge hypothesis

15
ERb Endometriozis

• Siçan Eosiz modelinde sadece ERa görülmüs
• ERb babun endometriotik lezyonlarinda gösterilmis
  
• ERb agonist siçanda Eosis implantlarini yok etmis
  i
• ERb agonist stimulating macrophages/NK cells ?
• Insan endometriumu ERb mRNA epithel
  hücrelerinde, daha çok proliferatif fazda
• Endometrioma ERa mRNA dominant ancak ERb daha
  artmis bir durumda
• ER? ve PR supresyonunda etkin olabilir

Harris et al Human Reprod 200520936 Matsuzaki
et al Fertil Steril 2000731219 Faleabas et al.
Fertil Steril 200380820 Bulun et al Semin
Reprod Med 20123039
16
Progesteron Reseptörü

• PR mRNA ekspresyonunu E2 regüle eder ancak PR
  promoterinde ERE yoktur
• Promoterde birçok transkripsiyon faktörü
  mevcuttur
• PR ekspresyonu ERa tarafindan pozitif yönde
  regüle edilir

Kastner et al EMBO J 199091603 Hewitt Korach
Steroids 200065551 Bulun et al Semin Reprod Med
20123039
17
AUG5
PR-B mRNA
1
3
2
4
5
8
7
6
5
3
AUG5
PR-A mRNA
1
3
2
6
4
5
8
7
5
3
AUG5
PR-C mRNA
3
6
4
5
8
7
5
2
???
3
PR-B
NH2
BUS
DBD
LBD
1
3
2
COOH
4
5
8
7
6
NH2
PR-A
DBD
COOH
LBD
PR-C
COOH
NH2
LBD
18
PROGESTERONE RECEPTOR ISOFORMS
BUS
DBD
LBD
PR-B
PR-A
PR-C

• PR isoforms (many more) PR-A, PR-B and PR-C.
• PR-B (116-kDa) is a strong transactivator of PR
  target genes.
• PR-A (94-kDa) may inhibit PR-B transcriptional
  activity in a cell type and promoter-specific
  context??
• PR-C (64-kDa) may be a suppressor of progesterone
  action and forms heterodimers with PR-B which
  interferes with PR-B-DNA binding.-one of the
  truncated isoforms of PR

19
PR AB izoformlari

• PRA daha çok endometrial stromada (94-kDa)
• Endometriosis implantlarda daha fazla
• ER aktivitesini inhibe edebilir
• P4 direncinde rol oynayabilir
• Meme kanserinin adhesivitesini artirabilir
• Fonksiyonu daha çok P4 yoksunlugu olan durumlarda
  ortaya çikabilir
• PRB daha çok endometrial glandlarda (116-kDa)
• E2 tarafindan endometrium ve T47D hücrelerinded
  özellikle artilirilan izoform

Attia et al JCEM 2000852897 Jacobsen et al Mol
Endocrinol 200519574
20
PR C (non A, non-B, kesilmis transkriptler)

• gt 7 transkript (ayni PR geninden)
• Hem nükleer hem sitoplazmik
• Tam bir DNA binding domaini yoktur
• Nükleus lokalizasyon sinyali mevcuttur
• Sitoplazmik fonksiyonu ?, diger TF lerle iliskisi
  ?
• P4 u baglar ama genomik etkisine engel olabilir
  Functional P4 withdrawal
• PR B ye baglanarak (heterodimer) PRE ni etkileme
  kapasitesini azaltabilir

Taylor et al Endocrinology 2006147687 Condon et
al Mol Endocrinol 200620764 Wei et al J Steroid
Biochem Mol Biol 199762287
21
Progesterone Causes a Rapid Induction of IkBa
Expression and Blocks IL-1?-Mediated Degradation
of IkB? Protein
(hTERT myometrial cell line)
Immunoblot
22
Progesterone Reduces NF-kB p65 Binding to the
Distal COX-2 Promoter in hTERT Myometrial Cells
23
Progesterone Suppresses the IL-1b/cAMP-induced
Expression of Aromatase Promoter IIa mRNA in T47D
Breast Cancer Cells.
Aromatase mRNA
Control
IL-1b
cAMP
24
Progesterone is Unable to Induce IkBa in PR-A/B
Deficient T47D Cells
n3
Progesterone 100 nM
25
Ablation of PR-A and PR-B Induces Expression of
hCYP19 Promoters IIa and I.3 in T47D Cells
siRNA --- PR-B PR-A/B MisM
PR-B PR-A Actin
26
Structure of the Human CYP19 Gene 5-Untranslated
Regions of CYP19 mRNA Transcripts are Encoded by
Unique Tissue-Specific First Exons (5UTRs)
I.3 Breast Cancer
The coding region and encoded protein (58kDa),
however, are identical regardless of the
promoter used Bulun et al Pharmacol Rev 2005
27
Endometriotik stromal hücrelerde aromataz
ekspresyon regülatörleri

• Negatif/nötral regülatörler
• Chicken ovalbumin upstream promoter transcription
  factor 2 (COUP-TF2)
• PGE2 receptor EP1 and EP3? No change or
  suppression in some systems
• Pozitif regülatörler
• SF-1
• cAMP
• CREB (cAMP response element binding protein)
• PGE2
• PGE2 receptor EP2, EP4 subtypes
• COX-2
• Cytokines IL-6 11, TNFa, Cortisol (promoter
  I.4)
• NF-kB regulated factors

• Noble et al 1996/1997, Zeitoun et al 1999,
  RichardsBrueggemeier 2003

28
Aromataz Indüksiyonu Lokalize bir olay

• Periton sivisinda steroid hormon düzeylerinde
  endometriosiz hastlarinda kontrol hastalara
  kiyasla bir fark gözlenmemistir (sitokin
  verilerinin tersine)

Mahmood TempletonBr J Obstet Gynaecol. 1991
Feb98(2)179-83.
29
Periton EndometriozisiVesiküler, saydam, kirmizi
lezyonlar

• Erken implantlar proliferatif endometriumu
  andirir
• Düsük sitokeratin and vimentin ekspresyonu
  immaturity (celllular disorganization)
• Yüksek P.Sivi sitokin düzeyleri (IL-8)
• Yüksek glandüler mitotik indeks (Ki-67)
• Yüksel MMPs tüm menstrual fazlarda
• Sonunda kahverengi/siyah ve skarifikasyon

30
Peritoneal EndometriosisBlack Lesions

• Presence of intraluminal debris
• Scarification, decreased vascularization
• No typical Progesterone changes
• Eventual white fibrotic lesions

31
AROMATAZ B- Negatif Ktrl red C-Kirmizi D-EU(geç
prolif.) E-siyah F-EU(sekr.) G-Eoma H-Normal
uterin periton (seroza) I-Plasenta Lokal yama
tarzi aromataz lokalizasyonu, kirmizi
implantlarda en yüksek derecede
Bukulmez et al Endocrinol 20081491190
32
CYP19IIa Endometrium (A,B) ve Implant/EU orani (C)
EU aromataz mRNAltlt Eosiz implantlar (Fig
C) Luteal P4 EU aromataz ekspresyonunu suprese
ediyor (B) rASRM evresi EU aromataz ekspresyonunu
degistirmiyor ancak implant aromataz ekspresyonu
evre I-II de artiyor C
33
CYP19IIa Lezyonlar morfoloji, menstrual faz,
periton
En yüksek aromataz kirmizi implantlarda
(A) Menstrual faza göre implantlarda degisiklik
yok (B) Yani luteal P4 implantlarda aromataz
ekspresyonunu etkilemiyor D-MPA tx suprese etse
de, ekspresyon düzeyleri EUya göre
yüksek Implantlarda Sinirli Progestin
etkisi Ileri evrede peritonda artmis ekspresyon
(C)
34
Aktivatör Supresör Aktivatör
855
377
35
COX-2 mRNA ERß mRNA to ER? mRNA orani
COX-2 en yüksek kirmizi implantlarda-Akut
inflamasyon ERß/ER? orani en yüksek
endometriomalarda-Kronik inflamasyon
36
ERß Immunostaining
A/B Prostat -/ C-Ctrl sekret endo. D-EU geç
sekr, E-Eoma F-Eoma G-Kirmizi H-Siyah I-Periton
(evre II) endotelde
Bukulmez et al Endocrinol 20081491190
37
PR
38
No PR-A in endometrioma cyst wall (chronic
inflammation)
Ctrl endometrium (Late prolif)
EU (Secretory)
Red Implant (Acute Inflammation)
Endometrioma
39
Nur 77 mRNA En yüksek endometriomada Kronik
inflamasyon göstergesi mi?
n 6 n 7 n 5 n 4 n8
n4
Bukulmez O. Minerva Ginecol 200961599
40
Negatif regülatör PG reseptörü
41
Can inflammation affect oocyte quality?

• PLoS one 20127e35535
• IL-6 induced deterioration in microtubule and
  chromosomal alignment
• in mouse oocytes

42
Inflammation and PTEN-PI3K-Akt-Foxo3 system

• Endometriosis
• P53 alterations
• PTEN (10q) and K-ras mutations
• PTEN mutations 12.5 of endometriotic tissues
• Increased mismatch repair abnormalities is
  associated with increased CRP levels
• Remember 10q26 linkage peak in endometriosis
• Chronic inflammation associated with mismatch
  repair abnormalities

43

• Genetically modified mouse models with
  oocyte-specific deletion of genes in the PTEN
  (Chr 10)-PI3K-Akt-Foxo3 pathway exhibit premature
  activation of all dormant follicles. PTEN
  inhibition and PI3K activation lead to Akt
  Plation and Foxo3 nuclear export in oocytes in
  primordial follicles resulting in follicular
  activation shown by increased AMH level
• Proc Natl Acad Sci U S A 201010710280-4.

Trends Endocrinol Metab 20102196-103.
44
Eutopic Endometrium
Aromatase
Retrograde menstruation
PF A4,T E2
Aromatase/Survival
PF
ROS Attachment Mesothelial injury
Implantation
NF-kB Nur77
PR-C
Cytokines- COX-2- Chemokines-Adhesion
molecules-Apoptosis inhibitors
ERb
PR-B PR-A
ERa
Aromatase
Red lesions Black lesions Fibrosis Deep
endometriosis Apoptosis
E2
45
Sonuç

• Endometrioma kist kapsülü-Kronik inflamasyon
  Implantlara göre daha düsük aromataz ve COX-2,
  düsük/yok PRA, yüksek SF-1 ve CEBP? yüksek
  ERß/ER? orani, yüksek PR-C, yüksek Nur77
• Implantlar kirmizi Yüksek aromataz, yüksek
  SF-1, yüksek COX-2, daha düsük PR-C implantlarda
  genel olarak yüksek EP2, EPI3, EPI4 (cAMP
  coupled)
• Inflamatuvar cevabin statüsüne göre dokulardaki
  aromataz ve nükleer reseptör ekspresyonu
  degismektedir.
• Sellüler kompozisyon lezyon morfolojisine göre
  variyasyon gösterir Akut (kirmizi) epitel
  hücreleri, inflamatuvar sizinti. Kronik (Eoma)
  stromal hücreler, histiositler, fibroblastlar.
• PR-C gibi kesilmis PR izoformlari ve ERß
  ekspresyonu kronik inflamatuvar cevapla korele
  olabilir
• Endometriozisin hormonal tedavisinin beklenen
  basariyi gösterememesinden lezyonlardaki
  inflamasyona bagli degisiklikler sorumlu olabilir.

46
Arastirma konusu

• Pelvik endomteriosizin medikal ve/veya cerrahi
  tedavisi pelvik ve de ovarian inflmasyonu
  kisitliyarak ya da elimine ederek endometriosizle
  iliskilendirilen azalmis over rezervini
  engelleyebilir mi?
• Tesekkürler!

47
Endometriosis/Receptors-reports

• Most implants (90) are out of phase with
  menstrual cycle
• ER and PR reduced as compared to eutopic
  endometrium (black lesions, deep lesions)
• Increased ER in implants (Red lesions)
• No cyclic changes in deep lesions
• Reduced exon 5 deleted splicing variant mRNA of
  ER-alpha (vs eu.endometrium)
• ER-a/ER-b mRNA 15.5 in eutopic endometrium, 5.5
  in endometriomas (deep)
• Higher ER-b/ER-a in endometriomas (vs eutopic)
• Higher PR-B mRNA in endometriomas
• No PR-B in extra-ovarian endometriotic tissues

48
Endometriosis/Enzymes

• Aromatase localized in cytoplasm of epithelial
  glandular cells of endometriosis implants
• Less 17bHSD2 in implants
• Eutopical endometriumaromatase can be expressed
  in the presence of severe endometriosis,
  adenomyosis, leiomyomas