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Intérêts de la culture cellulaire
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L'industrie des biotechnologies s 'est développée
de façon exponentielle ces dernières
années. L'Europe compte à présent plus de 1500
entreprises actives. La croissance des
biotechnologies s'appuie essentiellement sur une
communauté technologique formée par les
universités et les entreprises comme l'illustre
l'éclosion des biovallées. La cellule eucaryote
est au cœur de cet enjeu économique du 3
millénaire. En effet, elle constitue un véritable
laboratoire vivant utilisé pour tester, par
exemple, de nouveaux médicaments, ou encore dans
des études plus fondamentales du fonctionnement
et de la régulation d'un gène nouvellement
identifié et de son produit. Elle représente
aussi un moyen de transférer un ou plusieurs
gènes dans l'organisme. De plus, la cellule peut
être une usine productrice de molécules à usages
thérapeutique et diagnostique. Enfin, les récents
progrès accomplis dans la connaissance des
cellules souches annoncent de nombreuses
applications notamment en médecine régénératrice.
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Techniques générales de culture cellulaire
Caractérisation de la différenciation cellulaire
Mesure de la viabilité cellulaire et de la
croissance
Clonage cellulaire
Mesure du cycle cellulaire
Transformation cellulaire expression génique
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Mécanismes oncogéniques traitement ciblés
Identification cellulaire (ontogénese) ex
hématopoïèse
Production de cellules /tissus à visée
thérapeutique  ingénierie tissulaire  /
thérapie régénératrice
Méthode diagnostique
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Mécanismes oncogéniques / traitements ciblés
Ex les Leucémies Aigues (LA) Hémopathies malignes
caractérisées par un blocage de l hématopoïèse,
associé à laccumulation de cellules anormales ,
les cellules blastiques pronostic très
défavorable probabilité de guérison par
chimiothérapie environ 30 sauf pour un type
particulier la leucémie aigue promyélocytaire
(LAM3)
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LAM3
Formation d un gène de fusion codant pour une
protéine de fusion PML-RAR
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Différenciation d une lignée cellulaire
promyélocytaire, en présence d Acide Rétinoïque
Utilisation ATRA systématique dans le traitement
d induction des LAM3
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La leucémie myéloïde chronique (LMC)
Hémopathie myéloïde chronique caractérisée par
laccumulation des cellules de la lignée
granuleuse (myélémie) et le risque d évolution
vers une LA (acutisation)
t(922)
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Leucémie myéloïde chronique
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Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase
activity by STI 571, a selective tyrosine kinase
inhibitor Blood, Vol. 96 No. 3 (August 1), 2000
Hematologic and cytogenetic responses to imatinib
mesylate in chronic myelogenous leukemia N Engl J
Med. 2002 Feb 28
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Étude de l hématopoïèse
Progéniteurs différenciés -cellules engagées dans
une voie de différenciation régulée par des
facteurs de croissances -pas d autorenouvellemen
t -prolifération
CSH Totipotentes -autorenouvellement -différencia
tion capacité de générer lensemble des
cellules du sang périphérique
Précurseurs Morphologiquement identifiables
Maturation
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Progéniteurs différenciés -cellules engagées dans
une voie de différenciation régulée par des
facteurs de croissances -pas d autorenouvellemen
t -prolifération -pas d identification
morphologique
?
NFS
myélogramme
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FACS
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CFU-E
Cul tures
CFU-GM
CFU-MK
CFU-Eo
CFU-Ba
NFS
myélogramme
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Cellules Souches Hématopoïétiques totipotentes
Identification des cellules souches myéloïdes par
le système de culture à long terme (Dexter)
CSH Totipotentes -autorenouvellement -différencia
tion capacité de générer lensemble des
cellules du sang périphérique
système de culture à long terme adapté aux
cellules souches lymphoïdes (Witlock)
Caractérisation en cytométrie de flux
Modèles animaux
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Identification des progéniteurs myéloïdes
MHN
Culture 15 j. SH / SVF / HydroC
Irradiation à J 15
échantillon à tester
Nbre de CFU-GM LTC-IC
progéniteurs myéloïdes
Culture 5 semaines
Culture long terme (LTC) Système  Dexter 
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Identification des progéniteurs lymphoïdes
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In vitro identification of human pro-B cells that
give rise to macrophages,natural killer cells,
and T cells Damien Reynaud, Nathalie Lefort,
Elodie Manie, Laure Coulombel, and Yves
Levy-Blood 2003
Cellules de sang de cordon CD34/CD19-/CD10-
Culture sur lignée stromale (feder) IL2 / IL15
/ SCF
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Tri sous population CD127 (IL7a Rcp)
Cellule NK
Tests de différenciation cellulaire in
vitro culture en milieu liquide cytokines
macrophages
Cellule T
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Modèles animaux
Capacité des CSH de produire chez un receveur
irradié des cellules matures fonctionnelles des
lignées myéloïdes et lymphoïdes B et T
Souris immunodéficientes tolérantes aux greffes
xenogéniques (souris SCID, NOD-SCID) Système
xenogénique homme /mouton receveur fœtus de
mouton, système immunitaire non fonctionnel donc
tolérance vis à vis des cellules
humaines possibilité de développement d une
hématopoïèse humaine durable et transplantable à
des receveurs secondaires
Intérêt mesure du potentiel de reconstitution
in vivo de CSH test in vivo de facteurs régulant
l hématopoïèse
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Intérêts des cultures de progéniteurs médullaires
pour le diagnostic des syndromes
myéloprolifératifs (PV et TE).
Hémopathies caractérisées par une production
excessive de GR et/ou de plaquettes
Anomalie des cellules souches hématopoïétiques
prolifération non contrôlée possibilité de
croissance en milieu sans sérum et sans cytokine
Valeur diagnostique de la présence d une
croissance  spontanée  (EEC/EMC) en culture
clonogénique
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Diagnostic des Thrombocythémies Essentielles
Critères positifs plaquettes gt 600G/L BOM
augmentation du nombre de MK /myélofibrose
Critères dexclusion pas de PV pas de LMC
pas de myélofibrose idiopathique pas de syndrome
myélodysplasique pas de thrombocytose
secondaire
WHO classification of tumors PVSG classification
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TE valeur diagnostique des cultures
clonogèniques
?
Critères d exclusion pas de PV pas de LMC
pas de myélofibrose idiopathique pas de
syndrome myélodysplasique pas de thrombocytose
seondaire
CFU-MK
Critères positifs plaquettes gt 600G/L BOM
augmentation du nombre de MK
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The determination of spontaneous megakaryocyte
colony formation is an unequivocal test for
discrimination between essential thrombocythaemia
and reactive thrombocytosis.
Rolovic Z. et al. British Journal of Haematology
1995
EMC 24/24 TE 0/20 TS 0/18 sujets
sains 11/20 PV Thrombocytoses. 7/16
CML Thrombocytoses.
EEC 21/24 EEC 0/20 TS 20/20 PV
Thrombocytoses. 1/16 CML Thrombocytoses.
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Standardization and comparison of endogenous
erythroid colony assays performed with bone
marrow or blood progenitors for the diagnosis
of polycythemia vera The Hematology Journal
(2003) 0, 000000
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A STANDARDIZED ENDOGENOUS MEGAKARYOCYTIC /
ERYTHROID COLONY (EMC/EEC) ASSAY FOR THE
DIAGNOSIS OF ESSENTIAL THROMBOCYTHEMIA
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Intérêt de la standardisation
Quels milieux de cultures ?
CFU-MK
Quelle reproductibilité ?
Quelle valeur diagnostique ?
BFU-E
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Ingéniérie tissulaire / thérapie cellulaire
De nombreuses pathologies résultent d une perte
ou de l atteinte d un organe entraînant une
perte de cellules spécialisées , non
compensée maladie de Parkinson, déchirures
méniscales, maladie autoimmune (DID) IDM...
La possibilité de réparer ces atteintes par
 remplacement cellulaire  devrait permettre la
restauration de la fonction normale
Intérêt majeur sur la production de
cellules/tissus normaux dans un but thérapeutique
/ médecine régénérative
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Thérapie cellulaire autologue
Principe prélever des cellules/tissu
différenciés sur le receveur, expansion in
vitro/ex vivo ré-introduction sur le site de la
lésion pour  réparation 
Intérêt pas de conflit immunologique Limite
quantité de matériel disponible
Exemples réparation de déchirure méniscale par la
production ex vivo de chondrocytes autologues
Fibroblaste pour brûlure sévère Myocytes pour
réparation cardiaque
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Cellules ES et thérapie autologue
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Thérapie cellulaire allogénique
Tissus allogéniques et lignées cellulaires transp
lantation d organe, lignée cellulaire
continue ex lignée humaine neuronale et
AVC tissu allogénique
Cellules souches allogéniques greffe
allogénique de moelle ou de CSP dans les
hémopathies autres pathologies cellules ES
allogéniques

Tissue engineering and cell based therapies, from
the bench to the clinic The potential to
replace, repair and regenerate William L.
Fodor1Reprod Biol Endocrinol. 2003 Nov 13 1(1)
102
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Différenciation de Cellules ES de souris
Cellules ES
Corps embryoïdes
Précurseurs
ologodendrocytes
neurones
astrocytes
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Applications en thérapie cellulaire
Précurseurs oligodendrocytaire
Précurseurs motoneurones
Cellules ES
Précurseurs
Neurones dopaminergiques
Précurseurs
Précurseurs gliaux
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Ingéniérie tissulaire / thérapie cellulaire
1) Expansion cellulaire Objectif produire de
grande quantité cellulaire à visée
thérapeuthique Ex expansion de cellules
hématopoïétiques culture de kératinocytes
2) thérapie génique correction dun déficit par
transfection virale de cellules ex correction
de déficits immunitaires héréditaires liés à
l X, par greffe de CSH, Difficultés technique
! prolifération clonale maligne induite par le
retrovirus !
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Transplantation dÎlots Pancréatiques

• Technique
• Résultats actuels
• Perspectives

F. Bayle - PY. Benhamou Département dUrologie -
Néphrologie - Endocrinologie - CHU
Grenoble Groupe Rhin Rhône-Alpes Genève pour la
Greffe dÎlots de Langherans
Tours Octobre 2003
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(No Transcript)
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du Pancréas à lÎlot
Prélèvement
Conditionnement
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Tamisage
Digestion
Îlots avant purification
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Lavage
Purification Centrifugation Gradient de Ficoll
Îlots purifiés (Coloration Dithizone)
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Comptage
Test fonctionnel
Sécurité sanitaire
Conditionnement
Transport
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Injection intra-hépatique
Contrôle écho scopie Anesthésie
localeCathétérisme portal Injection des Îlots