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Distribución y concordancia del genotipo y
fenotipo de la N-Acetiltransferasa durante la
maduración en niños argentinos.
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• Introducción
• La isoniacida es metabolizada por la
  geneticamente polimorfa NAT2.
• Los diferentes alelos están relacionados con
  incremento o disminución de la capacidad de
  acetilación y en algunos casos disminución de la
  eficacia y toxicidad of isoniazida.
• Este polimorfismo potencialmente es responsable,
  en un número sustancial de individuos, de un
  incremento del riesgo de varios efectos adversos
  por drogas, incluyendo hemólisis por
  sulfasalazina, neuropatía inducida por hidrazina
  o arilamina, lupus eritematoso asociado a la
  terapia con procainamida e isoniazida y sindrome
  de Stevens-Johnson (necrolisis epidérmica tóxica)
  asociada a la administración de sulfonamidas.
• Existen resultados experimentales en otras
  poblaciones pediátricas sobre la influencia del
  desarrollo en la actividad NAT2, sin embargo en
  la Argentina no se ha determinado aún la
  distribución del tipo acetildador de acuerdo a la
  edad, por lo que las dosis se calculan
  extrapolando la información proveniente de otras
  poblaciones, lo que no garantiza la eficiencia y
  seguridad del tratamiento en nuestros niños.

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• Objetivos Generales
• Determinar la influencia del desarrollo
  pediátrico en el fenotipo acetilador
• Determinar las consecuencias de la maduración del
  fenotipo acetilador en la farmacocinética de la
  isoniacida en la población pediátrica argentina.
• Objetivos Específicos
• Determinar las características demográficas de la
  población.
• Determinar el genotipo de NAT2
• Determinar el fenotipo de NAT2 por análisis del
  Coeficiente metabólico molar acetilisoniazida/ison
  iazida.
• Correlacionar el Fenotipo con la Edad, analizando
  la frecuencia de acetiladores rápidos,
  intermedios y lentos por grupos etáreos de
  características similares.
• Correlacionar el fenotipo con las concentraciones
  plasmáticas de isoniacida
• Valorar las concentraciones de Isoniacida y sus
  implicancias en la terapéutica.
• Determinar si existen subgrupos poblacionales con
  mayor o menor riesgo de toxicidad /falta de
  eficacia del tratamiento.

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• Metodología
• Ambito de estudio Hospital General de Agudos
  Donación Francisco J Santojanni.
• Tipo de estudio Estudio piloto abierto, no
  randomizado.
• - Tipo de Estrategia Cuantitativa
• - Según los Objetivos Analítico Observacional
• - Según la intervención del investigador
  Observacional
• - Según la Temporalidad Transversal.
• Población Universo o población objetivo niños
  argentinos de 0 a 17 años.
• Población accesible
• pacientes de 0 a 17 años que concurran al
  Hospital Santojanni y reciban tratamiento con
  isoniacida, por quimioprofilaxis o por
  tratamiento de TBC.
• Tamaño muestral 50 individuos.

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• Metodología
• CRITERIOS DE INCLUSIÓN
• Edad de 0 a 17 años de edad
• Deban recibir isoniazida como quimioprofilaxis o
  terapéutica específica de TBC.
• Hemodinámicamente estables
• Función hepática normal determinada por AST, ALT
  y bilirrubina
• Función renal normal definida por un valor de
  creatinina dentro de los límites normales por
  edad y /o con un valor de creatinina que sea
  normal para ese paciente individual basado en su
  historia clínica
• Test de embarazo negativo en pacientes de sexo
  femenino en edad reproductiva.
• Firma del Consentimiento Informado
• Aprobado por el Comité de Etica del Hospital
• ICH E6 (13) e ICH E11(14)
• CRITERIOS DE EXCLUSIÓN
• Historia de alergia a la isoniazida

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• Metodología
• RECLUTAMIENTO DE PACIENTE
• Los profesionales encargados del seguimiento de
  los casos de TBC recibieron información detallada
  para poder
• Recolectar datos de los pacientes potencialmente
  incluíbles en el estudio.
• Citarlos para asistir al Hospital de Día
  Pediátrico en días y horarios adecuados para ser
  entrevistados por el investigador a fin de
  brindar la información del consentimiento
  informado, y obtener el mismo.
• En caso de aceptar se programará la extracción
  del laboratorio control 3 horas posteriores a la
  ingesta de la isoniacida, para con la misma
  venopuntura extraer el volúmen de sangre
  adicional necesario para el análisis de genotipo
  y fenotipo.
• - Durante la consulta el investigador obtendrá
  siguientes datos
• Datos Identificatorios del sujeto.
• Características antropométricas y
  epidemiológicas.
• Características del Tratamiento.

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• Metodología
• EXTRACCIÓN Y MANEJO DE LAS MUESTRAS
• Los individuos recibirán una dosis oral de 10
  mg/kg de isoniazida.
• Tres horas después de la dosis se extraerá 1 ml
  de sangre que se separarán en dos tubos
• Uno conteniendo 0,2 ml con EDTA (Genotificación)
• y otro heparinizado con 1 ml para
  fenotipificación de la NAT2.
• Ambas muestras serán transportadas en envases
  conteniendo hielo seco a 20 ºC al Centro de
  Farmacocinética para su procesamiento inicial y
  almacenamiento a 80C.

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• Metodología
• PROCEDIMIENTOS Y MÉTODOS ANALÍTICOS
• GENOTIPIFICACIÓN DE NAT-2
• AISLAMIENTO DE ADN GENÓMICO
• DETERMINACIÓN DE GENOTIPO DE NAT2 método de Blum
  M
• dos PCRs de 30 ciclos cada una, y el empleo de 2
  pares de primers para cada muestra
• Reacción 1 amplificará un fragmento de 1165-bp,
• P1 CACGACGTTGTAAAACGA CAGGGGATCATGGACATTGAA
• P2 TCTAGCATGAATCACTCTGC.
• La reacción 2 amplificará un fragmento de 652-bp
  empleando
• P3 CACGACGTTGTAAA y P4
  GGTTTGGGCACGAGATTTCT.
• ANÁLISIS DE RESTRICCIÓN
• Enzimas MspI/HpaII, KpnI, y BamHI detectan la
  pérdida de sitios de restricción en los
  nucleótidos nt 191, 481 y 857, respectivamente.
• El producto de la reacción 2 será digerido con
  TaqI para detectar pérdida del sitio nt 590.
• Los productos serán analizados en geles de
  agarosa al 1, salvo los digestos de TaqI, (geles
  al 2). Alelo variante sustitución en
  nucleótidos 191, 282, 481, 590, 803 o 857.
• Los individuos con dos alelos sustituidos serán
  clasificados como acetiladores lentos. Los
  heterocigotas con un alelo de tipo salvaje
  (wild-type) y una copia de un alelo variante, o
  con dos alelos de tipo salvaje, serán
  clasificados como acetiladores rápidos.

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• Metodología
• PROCEDIMIENTOS Y MÉTODOS ANALÍTICOS
• FENOTIFICACIÓN DE NAT-2
• Las concentraciones de isoniazida y
  acetilisoniazida se determinarán mediante HPLC
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• Cociente metabólico molar acetilisoniazida/isoniaz
  ida (MR) El MR será utilizado para separar la
  población en
• acetiladores lentos (MRlt0,48),
• acetiladores rápidos (MRgt0,77) y
• acetiladores intermedios (0,48ltMRlt0.,77)16.
• Este parámetro será tomado como prueba de la
  actividad de la N-acetiltransferasa.

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• Metodología
• Plan de análisis de los resultados.
• Las frecuencias de alelos y fenotipos se
  presentarán como porcentajes. La distribución del
  MR será estudiado por un histograma con los
  valores logarítmicos de MR, análisis probítico,
  log-lineal y pruebas normales.
• La muestra estudiada se categorizará en grupos
• Recien nacidos de 0 a 27 días,
• Infantes de 28 días a 23 meses,
• Niños de 2 a 4 años,
• Niños de 4 a 6 años,
• Niños de 7 a 17 años,
• La correlación entre MR y edad (coeficiente de
  correlación RHO) se evaluará con el Test de
  Spearman.
• La proporción de frecuencias acumulativas para
  acetiladores rápidos e intermedios será definida
  como la frecuencia de las mismas en niños por
  debajo de una determinada edad y se calculará por
  cociente entre el número de acetiladores rápidos
  e intermedios y el total de niños estudiados
  dentro del mismo grupo de edad.

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Resultados
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Resultados Obtenidos La técnica analítica y
reactivos Se han preparado por síntesis
orgánica los patrones de los posibles productos
metabólicos que deben ser utilizados para la
determinación tanto cuali como cuantitativa de
isoniazida y sus metabolitos en sangre periférica
de individuos que reciben tratamiento con dicho
fármaco. Una modificación de la técnica
descripta por Fox y Gibas, empleando síntesis
asistida por microondas, permitió obtener en
minutos el N-acetil-derivado como producto
único.   Corroboración de la estabilidad de las
muestras Tiempo y forma de conservación.  
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Resultados Obtenidos   Disponibilidad de
pacientes Se mantiene un registro de pacientes
en tratamiento con isoniacida y se han realizado
charlas con los profesionales encargados de su
cuidado verificando la factibilidad de su
inclusión en el estudio. Los niños que se han
juzgado pueden participar son contactados
periódicamente por el servicio de infectología
pediátrica, y controlados mensualmente con
laboratorio.   Número de sujetos incluídos
actualmente 38
14
Resultados Obtenidos   Características de los
pacientes incluídos
Sexo Sexo Sexo
Masculino 18 47
Femenino 20 53
Edad Edad
Promedio 6,9
Máximo 14
Mínimo 1
SD 4
Mediana 7
Modo 3
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Resultados Obtenidos   Características de los
pacientes incluídos
Peso (Percentilo) Peso (Percentilo) Peso (Percentilo)
3 a 10 0 0
10 a 25 3 8
25 a 50 18 47
50 a 75 14 37
75 a 90 3 8
90 a 97 0 0
Total 38 100
16
Resultados Obtenidos   Características de los
pacientes incluídos
Etnia Etnia Etnia
Indoamericana 4 11
Blanca 6 16
Mestiza 28 74
Total 38 100
Indicación Indicación Indicación
Profilaxis 33 87
Tratamiento 5 13
Total 38 100
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Resultados Obtenidos   Características de los
pacientes incluídos Fenotipo Acetilador 11
muestras analizadas
MR lt 4 Años gt 4 Años
lt0,48 2 2
0,48 a 0,77 2 4
gt0,77 0 1
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• Actividades pendientes
•  
• Inclusión de 12 pacientes adicionales
• Análisis del fenotipo de las muestras restantes
• Genotipificación de las muestras ya obtenidas y
  almacenadas
• Análisis de correlación entre genotipo y fenotipo

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Muchas Gracias