CH?N

1
CH?N ÐOÁN VI KHU?N LISTERIA B?NG K? THU?T GEN

• GVHD Nguy?n Ng?c H?iSinh viên th?c hi?n Ph?m
  Ng?c Hà

2

• I. Ð?t v?n d?
• II. N?i dung
• II.1. Ðôi nét v? Listeria
• II.2. Gi?i thi?u chung v? Listeria motocytogenes
• II.3. Chu?n doán Listeria monocytogenes b?ng k?
  thu?t gene
• III. K?t lu?n
• IV. Tài li?u tham kh?o

3
I. Ð?t v?n d?

• Trong s? sáu lo?i Listeria, ch? có Listeria
  monocytogenes gây b?nh Listeriosis r?t ph? bi?n ?
  c? ngu?i và d?ng v?t. Ðây là m?t lo?i b?nh th?c
  s? nguy hi?m vì nó có th? d?n d?n t? vong, d?c
  bi?t là d?i v?i nh?ng ngu?i có h? mi?n d?ch y?u
  nhu ph? n? có thai, tr? so sinh, ngu?i già y?u.
• Listeria monocytogenes t?n t?i trong th?c ph?m
  nên r?t d? lây nhi?m cho ngu?i dòi h?i ph?i có
  công tác ki?m nghi?m th?c ph?m kh?t khe.

4

• Thông thu?ng trong chu?n doán vi khu?n thu?ng
  áp d?ng k? thu?t nuôi c?y phân l?p trên m?t s?
  môi tru?ng chuyên bi?t và xác d?nh vi khu?n thông
  qua các ph?n ?ng sinh hóa Nhung do d?i tu?ng
  thao thác là trên th?c ph?m nên s? d?ng phuong
  pháp truy?n th?ng là r?t khó khan, t?n kém và m?t
  th?i gian. Nh? v?y mà các k? thu?t gene v?i nh?ng
  uu di?m n?i tr?i nhu nhanh, nh?y, chính xác dã
  du?c s? d?ng d? chu?n doán Listeria
  monocytogenes.

5
II. N?i dung

• II.1.Ðôi nét v? Listeria
• Gi?ng vi khu?n Listeria thu?c t?c
  Lactobacilleae g?m nh?ng tr?c khu?n nh?, không
  sinh bào t?, có lông ? m?t d?u nên có th? di
  d?ng, gam duong, có ph?n ?ng catalase duong tính,
  oxydase âm tính. Hi?u khí ho?c y?m khí tùy ý và
  có kh? nang lên men du?ng. Gi?ng này g?m nhi?u
  loài gây b?nh cho gia súc và ngu?i, trong dó có
  loài Listeria monocytogenes là loài gây b?nh s?y
  thai truy?n nhi?m ? c?u và làm tang s? b?ch c?u
  don nhân trong máu c?a nhi?u loài d?ng v?t nhu
  bò, ng?a, dê, c?u, heo, chu?t, k? c? ngu?i.

6

• Phân lo?i gi?ng Listeria bao g?m 6 loài
• 1. Listeria monocytogenes
• 2. L. innocua
• 3. L. ivanovii
• 4. L. seeligeri
• 5. L. welshimeri
• 6. L. grayi

7
II.2. Gi?i thi?u chung v? Listeria motocytogenes
8

• Phân b? và cách lây lan
• L. monocytogenes du?c phân b? r?t r?ng rãi, nó có
  trong d?t, nu?c, phân, d?ch ti?t du?ng sinh d?c
  và niêm m?c mui c?a d?ng v?t kh?e
• B?nh th? hi?n ? nhi?u d?ng và s? lây truy?n c?a
  vi khu?n có khác nhau. N?u nhu ? d?ng ph? t?ng,
  s? lây nhi?m qua du?ng an u?ng. N?u nhu ? d?ng
  th?n kinh ch? y?u lây nhi?m qua du?ng m?t và mui.

9

• Hình thái và nhu?m màu
• L. monocytogenes g?m nh?ng tr?c khu?n
  ng?n, hai d?u tròn, Gram duong. Trong môi tru?ng
  nuôi c?y, khi t? bào còn non L.monocytogenes du?c
  tìm th?y ? d?ng tr?c khu?n. Nhung tr? hon d?ng
  hình c?u (0,51-2 µm) l?i chi?m uu th?, dôi khi
  vi khu?n x?p thành chu?i ng?n(d? nh?m v?i
  Streptococcus), lúc này chiêm mao dài 6-20 µm. Vi
  khu?n không sinh bào t?, không t?o giáp mô, có
  kh? nang di d?ng. ? 20-250C vi khu?n di d?ng m?nh
  nh?t. ? 370C vi khu?n di d?ng nh? m?t chiêm mao ?
  d?u.

10

• Khi nhu?m t? mô b?nh ho?c d?ch nuôi c?y, dôi
  khi vi khu?n có d?ng hình c?u x?p chu?i d? nh?m
  v?i Streptococci. Trong tru?ng h?p này có th?
  dùng ph?n ?ng Catalase d? phân bi?t. Trong canh
  3-6 gi? ? 370C vi khu?n có d?ng tr?c, nuôi c?y
  3-5 ngày vi khu?n có d?ng dài 6-20 µm hay hon(d?c
  bi?t ch?ng R). S? di d?ng c?a Listeria dùng d?
  phân bi?t v?i Erysipelothrix.

11
Ð?c tính nuôi c?y và yêu c?u tang tru?ng
12

• Vi khu?n có th? phát tri?n trong di?u ki?m y?m
  khí. Nhi?t d? thích h?p 30-370C, pH 7,2-7,4 phát
  tri?n trên môi tru?ng nhung thu?ng s? d?ng môi
  tru?ng th?ch máu trong di?u ki?n 5-10 CO2 cho
  khu?n l?c tròn bóng, màu tr?ng, du?ng kính
  0,5-1mm và gây dung huy?t.
• Trên môi tru?ng Trytose agar t?o khóm sáng, tr?ng
  m? và có màu xanh lam (màu blue-green) khi quan
  sát du?i ánh sáng nghiêng.
• Trên môi tru?ng LSA (Listeria selective agar) t?o
  vòng den quanh khóm do s? phân gi?i Esculin sau
  24-48 gi?.
• Môi tru?ng Gelatin không gây tan ch?y.

13

• Ð?c tính sinh hóa
• Lên men ch?m các lo?i du?ng nhu glucose,
  rhamnose, salicin, levulose. Không lên men
  mannitol, xylose, lactose, saccarose. Ph?n ?ng
  Catalaza duong tính.

14

• S?c d? kháng
• Vi khu?n b? di?t ? 600C trong 30 phút và 720C
  trong 15 giây. Vi khu?n d? kháng v?i s? khô h?n.
  Có th? s?ng sót trong th?c ph?m và d?t nhung b?
  di?t b?i nh?ng ch?t sát trùng thông thu?ng.
• Nhay c?m v?i nhi?u lo?i kháng sinh nhung
  tetracycline cho k?t qu? t?t nh?t. Ngu?i ta có
  th? k?t h?p gi?a Trimethoprim v?i Sulphamethazol
  trong di?u tr?, vi khu?n kháng l?i v?i
  Quinolones. Erythromycine, ampicillin du?c dùng
  trong di?u tr? b?nh cho ngu?i.

15

• C?u trúc kháng nguyên và d?c t?
• C?u trúc kháng nguyên c?a L.monocytogenes
  ph?c t?p, du?c chia thành 16 serotype can b?n d?a
  trên kháng nguyên O và H.
• Kháng nguyên O B?n v?i nhi?t du?c chia
  thành 14 lo?i, ký hi?u 1-14.
• Kháng nguyên H Không b?n v?i nhi?t, chia
  làm 4 lo?ia, b, c, d. Hi?n nay có 3 ch?ng là
  nguyên nhân gây b?nh chính có c?u trúc kháng
  nguyên là 1/2a 1/2b 4b

16
SEROTYPE ANTIGENS ANTIGENS
SEROTYPE O(HEAT STABLE) H(HEAT LABILE)
1a 1b I, II, (III) I, II, (III) A, B A, B, C
2 I, II, (III) B, D
3a 3b II, (III), IV II, (III), IV A, B A, B, C
4a 4b 4ab 4c 4d 4e (III), (V), VII, IX (III), V, VI (III), V, VI, VII, IX (III), V, VII (III), VI, VIII (III), V, VI, VIII, IX) A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C
17

• Ð?c t?
• Vi khu?n s?n sinh ra men hemolysinase có tính
  kháng nguyên protein. Cytolysin có tác d?ng di?t
  t? bào. Trên b? m?t c?a t? bào vi khu?n còn có
  lipo-polysaccharid d?c d?i v?i th?.

18

• Co ch? gây b?nh
• T? lâu các nhà khoa h?c dã phát hi?n ra r?ng
  vi khu?n Listeria lây lan t? t? bào này sang t?
  bào khác trong co th? con ngu?i. Vi khu?n l?n lên
  trong m?t t? bào và di chuy?n nhanh chóng t?o
  thành m?t c?u trúc theo hình ngón tay nhô ra t?
  t? bào và d?y sang t? bào li?n k?. Khi dó vi
  khu?n s? ti?p t?c gây b?nh cho t? bào li?n k? dó.

19
(No Transcript)
20

• Giáo su Ireton và nhóm c?a ông dã phát hi?n ra
  m?t quá trình th? hai h? tr? vi?c lây lan c?a vi
  khu?n sang nh?ng t? bào kh?e m?nh
• Màng t? bào, hay l?p ngoài cùng c?a nh?ng t? bào
  kh?e m?nh thông thu?ng cang ra. Tình tr?ng cang
  dó du?c k? v?ng là có tác d?ng ngan ch?n vi khu?n
  không lây lan sang nh?ng t? bào chua nhi?m b?nh
  li?n k?.
• Tuy nhiên, phòng thí nghi?m c?a giáo su Ireton
  phát hi?n ra r?ng m?t lo?i pro-tê-in trong vi
  khu?n Listeria g?i là InIC xu?t hi?n làm gi?m di
  d? cang c?a màng t? bào ? nh?ng t? bào nhi?m
  b?nh, di?u này s? làm cho vi?c di chuy?n c?a vi
  khu?n d? xuyên th?ng màng t? bào và sau dó lây
  lan sang các t? bào kh?e m?nh li?n k? d? dàng hon.

21
(No Transcript)
22
Ch?n doán b?ng phuong pháp truy?n th?ng
23

• Tình hình d?ch b?nh Listeriosis
• Ca d?u tiên c?a b?nh Listeriosis dã du?c nói
  d?n cách nay 70 nam, nhung ph?i d?i d?n nh?ng nam
  1980 vi khu?n L. monocytogenes m?i du?c chính
  th?c xác nh?n là tác nhân gây ra b?nh ng? d?c t?
  th?c ph?m.
• T? tháng m?t d?n tháng tám nam 1985, t?i M?
  có m?t d?t bùng phát khác v?i 142 ca nhi?m b?nh
  Listeriosis.
• Vào nh?ng nam 1990, B? Nông nghi?p Mi cho
  bi?t có m?t tr?n d?ch b?nh này t? bánh mì k?p xúc
  xích nóng và có th? là các c?a hàng bán th?t ngon
  d?n d?n ít nh?t 101 ngu?i b? b?nh khi?n 15 ngu?i
  l?n t? vong và 6 thai nhi b? sinh non.

24

• Nam 1999, loài L. monocytogenes d?c bi?t c?c d?c
  dã ti?n tri?n báo d?ng các viên ch?c y t? và h?
  bu?c nh?ng nhà s?n xu?t th?c ph?m ph?i gi?i quy?t
  v?n d?.
• Nam 2002, d?t bùng phát d?ch b?nh Listeriosis ?
  nhi?u bang ? M? m?t can b?nh nguy hi?m do vi
  khu?n Listeria gây ra -dã xác nh?n có 46 ca nhi?m
  b?nh, 7 ca t? vong và 3 ca h?ng bào thai.
• M?c dù quy d?nh t?m th?i d?i v?i các s?n ph?m
  th?t và th?t gia c?m ch? bi?n s?n phát hành nam
  2003 giúp ki?m soát s? bùng phát vi khu?n, nhung
  rõ ràng dã không th? lo?i b? du?c b?nh hoàn toàn.
  Theo Trung tâm y t? d? phòng CDC, u?c tính 2.500
  ngu?i b? b?nh Listeriosis n?ng m?i nam, trong s?
  dó có 500 ngu?i t? vong. Ngu?i có nguy co cao có
  th? m?c b?nh này sau khi an th?c ph?m th?m chí
  ch? nhi?m vài con vi khu?n.
• Nam 2008 ? d?ch Listeriosis ? Canada nguyên nhân
  t? nhà máy Maple Leaf Foods ? Toronto, Ontario
  làm hai muoi hai ngu?i ch?t và có t?ng s? 57
  tru?ng h?p nhi?m b?nh.

25
II.3. Chu?n doán Listeria monocytogenes b?ng k?
thu?t gene

• D?a tên 3 gene gene DTH-18, gene listeriolysin O
  (hly A) và iap

26
Phân l?p L.monocytogenes t? phô mai

• 25g phô mai d?ng nh?t v?i 225ml dung d?ch tang
  sinh Listeria(LEB)-làm giàu m?u l?n 1 gt L?y
  0,1ml chuy?n qua 10ml canh Fraser (Oxoid) và ? 24
  gi? ? 300C làm giàu m?u l?n 2gtthu nh?n t? bào
  b?ng IMS gt L?y 10µl d? th?c hi?n ph?n ?ng PCR.

27
S? d?ng primer

• Primer 1 5-CTAATCAAGACAATAAAATC-3 Gi?a v? trí
  536bp và 555bp.
• Primer 2 5-GTTAGTTCTACATCACCTGA-3. Gi?a v? trí
  1037bp và 1056bp.

28
H?n h?p ph?n ?ng PCR 100µl

• 1.25U Taq polymerase
• 100µM m?i lo?i dNTP
• 0.5µM m?i primer
• 10µl DNA m?u
• 10nM Tris HCl (pH8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl,
  0.001 (Wt/vol) gelatin.

29
Ph?n ?ng PCR du?c th?c hi?n 30 chu k?
30

• S?n ph?m t?o thành du?c di?n di trên gel agarose
  1 nhu?m ethidium bromide ho?c du?c l?c b?ng
  Z-probe(Bio-Rad) và lai v?i DNA probe mã hóa cho
  gene DTH-18. Probe listeriolysin O du?c dánh d?u
  s? d?ng trong PCR. Ði?u ki?n tuong t? nhu miêu t?
  ? trên ngo?i tr? 100µl th? tích ph?n ?ng ch?a
  90µM dNTP và 10µM digoxigenin-dUTP. PCR d?a trên
  gene listeriolysin O dùng d? xác d?nh ki?u huy?t
  thanh 4a.

31
S?n ph?m c?a ph?n ?ng khu?ch d?i PCR t? m?u phô
mai có ch?a Listeria monocytogenes sau khi dã làm
giàu m?u (A). 1µl m?u (lane 1 d?n
lane 4), 2µl m?u (lane 8 d?n lane 11) t? dung
d?ch làm giàu m?u. (B) k?t qu? PCR
sau khi th?c hi?n mi?n d?ch t? phân tách(IMS) c?a
100µl m?u Listeria (lane 1 d?n lane 4). Tru?c
khi làm giàu m?u, 25g phô mai phân tích ch?a 0
(B?ng A,lane 1 và 8. B?ng B, lane 1), 0.4 (B?ng
A, lane 2 và 9. B?ng B, lane 2), 4 (B?ng A, lane
3 và 10. B?ng B, lane 3), 40 ( B?ng A, lane 4 và
11. B?ng B, lane 4) CFU/g phô mai. Lane 6 không
ch?a L. monocytogenes. S? ki?m tra kh?ng d?nh
ch?a 0,05µg DNA L.monocytogenes tinh khi?t (lane
5). Phage lambda DNA Pst I s? d?ng làm ch?t ch?
th? phân t? (lane7).
32
S?n ph?m c?a ph?n ?ng khu?ch d?i PCR t? m?u phô
mai du?c làm giàu l?n 1 và 2. 1µl m?u (lane 1 d?n
lane 4), 2µl m?u (lane 8 d?n lane 11) t? dung
d?ch làm giàu m?u l?n 2. K?t qu? th?c hi?n PCR
sau IMS c?a 100µl m?u Listeria (lane 1 d?n
4) Tru?c khi làm giàu m?u, 25g phô mai phân tích
ch?a 0 (B?ng A,lane 4 và 11. B?ng B, lane 4), 1
(B?ng A, lane 1 và 10. B?ng B, lane 1), 10 (B?ng
A, lane 2 và 9. B?ng B, lane 2), 100 ( B?ng A,
lane 3 và 8. B?ng B, lane 3) CFU/g phô mai. Lane
6 không ch?a L. monocytogenes. S? ki?m tra kh?ng
d?nh ch?a 0,05µg DNA L.monocytogenes tinh khi?t
(lane 5). Phage lambda DNA Pst I s? d?ng làm
ch?t ch? th? phân t? (lane7).
33

• S? d?nh lu?ng L.monocytogenes v?i
  SYBRGreen/Real-Time PCR Assay.Gen
  listeriolysin(hly A) du?c ch?n làm m?c tiêu d?
  xác d?nh L.monocytogenes.
• M?i xuôi5-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3
• M?i ngu?c5-CACTGCATCTCCGTGGTACTAA-3
• Ðu?c s? d?ng d? khu?ch d?i do?n 113bp c?a gene
  hly A(Nogva et al,2000)

34

• Ð?nh lu?ng Real-Time PCR du?c th?c hi?n b?i
  máy luân nhi?t M3005(Stratagene, La Jolla, CA,
  USA) trong 25µl th? tích cu?i ch?a 9,5µl m?u DNA,
  300mM m?i xuôi và m?i ngu?c(DNA Technology,
  Arhus, Denmark) và 12,5µl 2High power SWBR Green
  PCR Master M(Applied Biosystems, Foster City, CA,
  USA)

35

• PCR bao g?m 45 chu k?, m?i chu k? có 3 bu?c
  bi?n tính ? 950C/15 giây,b?t c?p/ kéo dài ?
  600C-60 giây. Phân tích melt-curve gi?a 55-950C
  d? ki?m tra s? d?c hi?u c?a ph?n ?ng khu?ch d?i.
  Ðu?ng cong chu?n du?c xây d?ng t? các n?ng d? pha
  loãng c?a t? bào vi khu?n và quan sát chu k?
  ngu?ng Ct.

36
Xác d?nh và phân tích s? khác nhau c?a các loài
Listeria b?ng Multiplex PCR

• S? d?ng gen iap. Thi?t k? 5 m?i khác nhau d?
  xác d?nh các loài Listeria b?ng Multiplex
• Ino 25-ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3
• Khu?ch d?i do?n gene c?a L.innocua dài 870bp
• Siwi 25-TAACTGAGGTAGCGAGCGAA-3
• Khu?ch d?i do?n gene c?a nhóm L.ivanovii,
  L.seeligeri và L.welshimeri dài 1,2kb.

37

• Mono A5-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3
• Khu?ch d?i do?n gene c?a L.monocytogenes dài
  660bp
• Primer Mugrad
• Khu?ch d?i do?n gene c?a L.gayi và L.murrayi
  dài 480bp
• Lis 1B5-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3
• Ð?c hi?u cho loài Listeria

38
Xác dinh và phân bi?t các loài Listeria d?a trên
Multiplex PCR ch?a 5 primers MugraI, MonoA, Ino2,
and Siwi2, and Lis1B (Lis-Mix). Th?c hi?n ph?n
?ng trong 30 chu k? (bi?n tính ? 95C/15 giây,
b?t c?p 58C/30 giây, kéo dài 720C/45 giây) v?i
lane 1 chu?n
39
III K?t lu?n

• Càng ngày có nhi?u nguy co gây h?i cho s?c kh?e
  c?a con ngu?i và v?t nuôi, Listeriosis là m?t
  trong nh?ng nguy co nguy hi?m và nó càng dáng
  quan tâm hon khi nguyên nhân x?y ra hi?n di?n ?
  kh?p m?i noi d?c bi?t là trong th?c an c?a con
  ngu?i. S? d?ng phuong pháp truy?n th?ng d? nh?n
  bi?t s? t?n t?i c?a Listeria dòi h?i ph?i th?c
  hi?n các ph?n ?ng sinh hóa nhu lên men du?ng,
  CAMPtrong phòng thí nghi?m và ti?n trình này c?n
  th?i gian t?i thi?u là 7 ngày theo International
  Dairy Federation (IDF) tiêu chu?n 1431995

40

• Ði?u này không dáp ?ng du?c yêu c?u trong
  ch?n doán b?nh nh?t là khi b?c phát d?ch b?nh.
  V?i s? ra d?i và du?c c?i ti?n t?ng bu?c k? thu?t
  PCR là phuong pháp nhanh, nh?y, chính xác d? xác
  d?nh vi khu?n Listeria nói chung và
  L.monocytogenes nói riêng. M?t khác hi?u qu? c?a
  PCR còn du?c tang lên r?t nhi?u l?n khi s? d?ng
  k?t h?p v?i phuong pháp IMS. Thêm vào dó c?i ti?n
  PCR ta có du?c Multiplex PCR phuong pháp này cho
  phép ta phân bi?t rõ ràng gi?a các loài Listeria,
  vì cho dù ch? có L.monocytogenes là tác nhân gây
  b?nh th?c s? nguy hi?m nhung trên th?c t? s? t?n
  t?i c?a loài này không nhi?u thì ít cung có liên
  quan d?n s? hi?n di?n c?a các loài Listeria khác.

41
IV. Tài li?u tham kh?o

• 1. http//www.khoahoc.vn.com
• 2. Tô Minh Châu- Tr?n Th? Bích Liên(2001). Vi
  khu?n và n?m gây b?nh trong thú y.
• 3. http//www.nature.com
• 4. http//scholar.google.com.vn
• 5.http//www.khoahoc.net/baivo/nguyenthuongchanh/1
  30907-vikhuanlisteria.htm
• 6. http//en.wikipedia.org/wiki
• 7. http//www.pasteur-hcm.org.vn/tinchitiet.jsp?ma
  _bv146
• 8. http//www.springerlink.com/content/100229/
• 9. William Burrows, Robert Murdoch Lewert, John
  Willarel Rippon(1968). Fex book of microbiology-
  The pathogenic Microorganisms.