Real-time PCR v diagnostice MRD a v

1
Real-time PCR v diagnostice MRD a vývoji
metastáz u neuroblastomu

• Kadlecová J.1, Kratochvílová A. 1, Ravcuková B 1
  , Valášková I. 1, Gaillyová R. 1 a Šterba J2.
• 1 Oddelení lékarské genetiky, 2 oddelení detské
  onkologie FN Brno

2
Neuroblastom

• Nádor periferního nervového systému
• Patrí mezi nejcastejší detské solidní tumory
• 8-10 všech pediatrických nádorových onemocnení
• 40 prípadu diagnostikováno do 12ti mesícu a 90
  do 5ti let veku pacienta
• Incidence 5-10 nemocných na jeden milion detí
• Odvozený od migrujících primitivních bunek
  neurální lišty autonomního nervového systému
• Primární ložiska dren nadledvinek, ganglia
  sympatiku
• U gt50 pacientu v dobe stanovení diagnosy
  zjišteny metastáze do ostatních orgánu (casne
  metastázující)
• O molekulárním mechanismu rustu, diferenciace a
  programované smrti NBL je stále velmi málo
  informací

3
Klinická stádia neuroblastomuKlasifikace podle
Evanse (Childrens Cancer Study Group


Staging System for Neuroblastoma)

• Stadium I
• Stadium II
• Stadium III
• Stadium IV
• Stadium IV-S

• -Ložisko nádoru je vymezeno orgánem,ve kterém
  nádor vznikl
• -Nádor se rozširuje mimo puvodní ložisko,
  ale neprekracuje strední linii. Mohou být
  zasaženy regionální lymfatické uzliny v blízkosti
  nádoru.
• -Nádor se celkove rozširuje za strední linii,
  jsou zasaženy lymfatické uzliny na obou stranách
  tela.
• -Nádor metastázuje do vzdálených orgánu
  (lymfatické uzliny, kosti a kostní dren, játra,
  kuže).
• -Zahrnuje stádia I a II u detí mladších 12
  mesícu,s metastázemi v játrech, kuži, kostní
  dreni, ale kosti nejsou zasaženy.

4
Prognostické faktory

• Vek
• Stadium choroby pri diagnose
• Histopatologický nález
• Hladiny biochemických markeru v krvi a moci
• k.vanilylmandlová a homovanilinová, ferritin,
• neurospecifická enoláza, laktátdehydrogenáza,
• katecholamin a jeho deriváty
• Genetické faktory ? ploidie bunky, stupen
  amplifikace
• N-myc protoonkogenu?HSRs, delece 1p36(obsahuje
  gen
• pro nádorový supresor)?LOH, dmins, úroven
  exprese
• genu pro TH, TRK A a C, GD2 syntetázy,
  telomerázová aktivita....

5
Genová exprese v bunkách neuroblastomu
molekulární markery

• Rozdílná genová exprese

• prubeh nemoci
• príznivý vs. nepríznivý

neuroblastom vs. normální tkán

• Tkánove specifická exprese
• gen TH
• GD2 syntetáza
• Nádorove specifická exprese
• geny MAGE, GAGE

Trk A Trk C
n-myc
Trk B
n-myc
telomerázová aktivita (hTERT)
telomerázová aktivita (hTERT)
Zmena úrovne exprese
6
Klinický význam molekulárních markeru

• ? stanovení diagnósy
• ? sledování prubehu onemocnení (MRD, relaps)
• ? detekci NB bunek v transplantátu pred
• autologní transplantací
• ? urcení prognósy

7
Tyrosinhydroxyláza (TH)

• 1.enzym dráhy syntézy katecholaminu
• katecholaminy
• duležité neurotransmitery a hormony, regulují
  vnitrní funkce
• a motorickou koordinaci
• jsou sekretovány 98 NB (NB je endokrinne aktivní
  )
• jejich metabolity používány pro sledování prubehu
  onemocnení
  
• exprese TH genu je regulována tkánove specificky
  behem neonatálního vývoje a diferenciace
• - lokalizace genu TH v oblasti 11p15.5

8
MAGE 1- 6 a GAGE 1-8

• Genové rodiny
• Kódují nádorové antigeny
• Jejich produkty (vázané na MHC) jsou rozpoznávány
  cytotoxickými T lymfocyty
• Exprimovány širokým spektrem lidských nádoru (NB,
  melanom, k.plic, žaludku, prsu...)

9
Detekce exprese MAGE1-6/ GAGE1-8 pomocí
real-time PCR
10
Neurotrofinové receptory trk A, B a C

• neurotrofiny a jejich receptory
• regulují proliferaci, diferenciaci a smrt
  normálních i neoplastických bunek nervové tkáne
• tyrosin-kinázové membránové receptory trk A, B,
  C jsou nezbytné pro vysokou vazebnou afinitu a
  plnou biologickou funkci neurotrofinu a hrají
  duležitou roli v biologii a klinickém chování
  neuroblastomu
• vazebný ligand pro trk A receptor je NGF (nerve
  growth factor), pro trk B receptor BDNF (brain
  derived nerotrophic factor, pro trk C receptor
  NT-3 (neurotrophin 3)

11
Kvantitativní stanovení transkriptu genu trk A
pomocí real-time PCR
trk A
h-?2M
Relativní kvantifikace. Koncentrace cílové
sekvence (trk A) je vyjádrena v pomeru ke
koncentraci referencního (housekeeping ) genu ,
napr. ?2M (?2-Microglobulin gene) . K výpoctu
koncentrací je užívána standardní kalibracní
krivka.
12
Telomerázová aktivita (TA)

• Telomeráza
• multiproteinový komplex
• lidská telomerázová reversní transkriptáza
  (hTERT)
• vnitrní RNA retezec (hTR)
• RNA vazebný protein (hTEP1)
• podíl na vývoji a progresi maligních nádoru
• TA
• je detekována v obnovujících se a rychle se
  delících bunkách (zárodecné a nádorové bunky)
• muže být zachycena v hyperplastických a jiných
  než neoplastických tkáních marker
  proliferace
• prognostický marker neuroblastických nádoru,
  vysoká TA (exprese hTERT) koreluje s agresivním
  biologickým chováním

13
GD2 syntetáza

• témer všechny tkáne neuroblastomu
  vysokou úroven GD2 gangliosidu
• normální bunky (ne neurálního puvodu)
  minimální nebo nulová hladina GD2 gangliosidu
• GD2 syntetáza (?-1,4-N-acetyl-galactosaminyl
  transferáza)
• klícová role v biosyntéze GD2 gangliosidu
• aktivita koreluje s expresí GD2 na povrchu bunek
• senzitivní a specifický molekulární marker pro
  detekci bunek odvozených od neurální lišty

14
Záver

• Zavedení vysoce citlivé metody real-time PCR k
  detekci i ke kvantifikaci nádorových markeru
  umožnuje
• odhad rizika vývoje metastáz v case diagnózy
  nemoci
• prognózu lécebné odpovedi
• testování kmenových bunek pred autologní
  transplantací
• kombinací více molekulárních markeru s dalšími
  nezávislými metodami detekce ( imunocytologickými,
  histologickými) je možno zvýšit detekcní
  možnosti nádorové diagnostiky.
• Je možno postihnout heterogenitu NB ? zvýší
• se pravdepodobnost záchytu NB

15

• Podekování patrí predevším spolupracovnicím z
  laboratore molekulární genetiky OLG Brno
• a také Dr. S. A Burchill z oddelení detské
  onkologie,St.Jamess University Hospital, Leeds
• za laskavé poskytnutí bunecné linie neuroblastomu
  IMR-32