Amerikan Tiroid Birligi (ATA) Kilavuzu Kemirgen ve H

1
Amerikan Tiroid Birligi (ATA) Kilavuzu
Kemirgen ve Hücre Modellerinde Tiroid Hormon
Ekonomi and Etkisininin Arastirilmasi
2
GIRIS

• Son 150 yil içinde hayvan ve hücre kültürü
  temelli deneysel modeller, tiroid fizyolojisi ve
  hastaliklarini anlamamizi saglayan çok önemli
  kesifler ortaya çikarmistir.
• Insanlar ve küçük kemirgenler arasinda tiroid
  fizyolojisinin çesitli yönlerden büyük benzerlik
  göstermesi, deneysel bulgularin hizli bir seklide
  klinik alana aktarilmasini kolaylastirmistir.
• Belirli deneysel teknikler yaygin biçimde kabul
  görmekle birlikte, standardizasyon eksikligi
  süphesiz sonuçlarda heterojenlige yol açmistir.

3
GIRIS

• Belirli deneysel degiskenlerin biyolojik esik
  degerlerinin bilinmemesi ayni konuyu inceleyen
  farkli çalismalarin sonuçlarinin uyumsuzluguna
  yol açabilir.
• Standardizasyon eksikligini gidermek amaciyla
  Amerikan Tiroid Birligi (ATA) rodent ve hücre
  modelli tiroid çalismalari için strateji ve
  yaklasim konsensusu tanimlamak amaciyla temel
  tiroid arastirmalari alaninda uzmanlasmis
  kisilerle bir panel düzenlemistir. Uzmanlar
  literatürü tarayarak ilk olarak
  standardizasyondan fayda görecek deneysel
  uygulamalari tespit etmek ve ikincil olarak ta
  tiroid çalismasi dizayn edilirken önem gerektiren
  kritik deneysel degiskenleri belirlemekle
  görevlendirilmistir. Çalisma grubunun önerileri
  Amerikan Tiroid Birliginin tiroid hormon ekonomi
  ve rodent ve hücre modellerine etkisini arastirma
  kilavuzu olarak yayinlanmistir.

4
A TiROiD BEZiNiN DEGERLENDiRiLMESi

• A.1 YAPI-FONKSIYON ILISKISI
• ÖNERI 1
• (a) Tiroid foliküllerinin morfometresi tiroidal
  aktivite endeksi olarak kullanilabilir.
• (b) Otoradyografi tiroid foliküllerinin toplam
  aktivitesinin miktarinin belirlenmesi ve folikül
  içinde iyot lokasyonunun tespiti için
  kullanilabilir.
• (c) Tiroid folikülleri içinde iyotun
  ultrastrüktürel dagilimi ikincil iyon kitle
  spektrometrisi ile tanimlanabilir.
• (d) Tiroid folikülleri, çevre kapiller ag ve
  stromadaki protein ekspresyonunu çalismak için
  immünohistokimya ile birlikte konfokal mikroskopi
  iki veya üç boyutlu görüntü rekonstrüksiyonu
  amaciyla kullanilabilir.

5
A.2 TIROID IYOT KINETIKLERI

• ÖNERI 2
• Bazolateral hücresel iyot uptake ve iyot apikal
  akisi (efflux) yari geçirgen membran üzerinde
  kültürize edilerek iki-bölmeli sistem olusturulan
  tek tabakali polarize hücreler veya FRTL-5 ile
  PCCL3 rat tiroid hücre serileri gibi polarize
  olmayan hücre modellerinde çalisilabilir.
  Tirositten iyot akisi perklorat uygulanmis tiroid
  hücre serilerinde incelenebilir.
• ÖNERI 3
• (a) Tiroid bezinin iyot uptake kinetigi
  radyoaktif iyot uygulamasi yoluyla çalisilabilir.
  Veriler in vivo olarak veya trakea ve tiroidin en
  blok rezeksiyonunu takiben elde edilebilir.
• (b)Tiroid iyot organifikasyon miktari perklorat
  atim testi ile ölçülebilir.
• (c) Tiroidal sekresyon kinetikleri trakea ve
  tiroidin en blok rezeksiyonu kullanilarak in
  vitro olarak çalisilabilir.

6
A.3 TIROID GÖRÜNTÜLENMESI

• ÖNERI 4
• Tiroid bez fonksiyonel görüntülenmesi radyoaktif
  iyot izotoplari kullanilarak gama kamera ile
  görüntü eldesi veya mikro-PET-CT yoluyla
  yapilabilir.
• Tiroid bezinin morfolojik mikrogörüntülenmesi
  yüksek frekansli ultrason ile yapilabilir.

7
B DOLASIMDAKI VE DOKUDAKI TIROID HORMON
DÜZEYLERININ DEGERLENDIRILMESI

• B.1 SERUM
• ÖNERI 5
• Serum total T4 ve T3 konsantrasyonlari standart
  egrileri, rodent serumundan elde edilen tiroid
  hormonu kullanilarak hazirlanmis radyoimmunassay
  (RIA) veya ELISA ve IRMA gibi diger
  immunoassayler kullanilarak ölçülebilir.
• Fibrin olusumunun pipetlemeyi etkilemesi ve
  heparin gibi eklentilerin direkt olarak serbest
  hormon tespitini engelleyebileceginden ötürü,
  dolasimdaki T4 ve T3 ü ölçen tetkikler, plazmadan
  ziyade en iyi serum kullanilarak yapilir.
• Serumdaki serbest iyodotironin endekslerinin
  (FT4I ve FT3I) tespiti, total serum hormon
  konsantrasyonu ve serum iyodotironin baglama
  kapasitesinin resin veya aktif kömür
  metotlarindan biri kullanilarak ölçümü ile elde
  edilebilir.
• Ardisik izotop dilüsyon kitle spektrometrisi
  biyolojik örneklerde T4 ve T3 ölçümü için
  kullanilabilir.

8

• ÖNERI 6
• (a) Rat ve fare serum TSHu ticari olarak elde
  edilebilen rat TSH kitleri ile ölçülebilir.
  Alternatif olarak, türe özgül RIA lar, Ulusal
  Hormon ve Peptid Programi, Ulusal Diabet,
  Sindirim ve Böbrek Hastaliklari Enstitisünden
  (Bethesda, MD) alinan preperatlarla
  uygulanabilir.
• (b) TSH biyolojik aktivitesi standardize in vitro
  tahlillerle çalisilabilecegi gibi in vivo
  tahlillerle de çalisilabilir.
• ÖNERI 7
• Tirotiropin releasing hormone (TRH) ile
  indüklenen TSH sekresyonu testi pitüiter bezin
  TSH salma kapasitesini degerlendirmek için
  kullanilanbilir. TSH ile indüklenen tiroidal
  sekresyon testi tiroid bezinin tiroid hormone
  üretim ve sekresyon kapasitesini degerlendirmek
  için kullanilabilir.

9
B.2 DOKU
B.3 DOKU T3 VE TIROID HORMON RESEPTÖR (TR)
SATÜRASYON KAYNAKLARI

• ÖNERI 9
• (a) Plazma T3nün doku T3üne istirak miktari
  radyoisaretli T3 izleyicilerinin tek intravenöz
  enjeksiyon veya pompa yardimli kronik infüzyonunu
  içeren doku-isaretleme teknikleriyle
  ölçülebilir.
• (b) Dokudaki TR maksimum baglama kapasitesi, T3
  ile satürasyon analizi ve Scatchard metodu
  kullanilarak veri redüksiyonu yoluyla tahmin
  edilebilir.
• (c) 131I-T3 ve 125I-T4 kullanilarak uygulanan
  dual-isaretleme teknikleri plazma T3ü ile lokal
  olarak üretilen T3ün, T4 deiyodinasyon yoluyla
  doku T3 konsantrasyonuna rölatif katkisinin
  tespitinde kullanilabilir.

• ÖNERI 8
• Doku T3 ve T4 içerigi doku ekstraksiyonu sonrasi
  immunoassaylerle ölçülebilir.

10
C HÜCRE IÇINE TIROID HORMON TRANSPORTUNUN
DEGERLENDIRILMESI

• C.1 IN VITRO TIROID HORMON TRANSPORTU
• ÖNERI 10
• (a) Hücre içine iyodotironin transportu, geçici
  olarak vahsi tip veya mutant tiroid hormone
  transportörleri eksprese eden hücrelerde
  çalisilabilir.
• (b) Tiroid hormon transportörleri için substrat
  özgüllük ve kinetik karakteristiklerinin tespiti,
  çesitli substratlarin genis bir substrat
  konsantrasyonu araliginda test sonuçlariyla
  baglanti gerektirir.
• (c) Karisik hücre kültürleri kullanilmasi
  halinde, in vitro disosiye primer hücre
  kültürlerinde tiroid hormon transportunun
  degerlendirilmesinin sadece sinirli bir degeri
  vardir.
• ÖNERI 11
• Gerçek plazma membran lokalizasyonunun
  konfirmasyonu tiroid hormon transportörlerini
  geçici olarak eksprese eden hücreler kullanilarak
  yapilan çalismalar için yararlidir.

11
C.2 IN VIVO TIROID HORMON TRANSPORTU

• ÖNERI 12
• (a) In vivo çalismalar için, net tiroid hormon
  transportu tipik olarak bir dizi farkli
  transportör aktivitelerinin toplamini ifade eder.
  Belli bir transportörün net transporta katkisinin
  degerlendirilmesi dokuda eksprese olan tüm
  transportörlerin incelenmesini gerektirir.
• (b) Degerlendirilen tiroid hormonlarinin
  metabolizmasi in vivo transport ölçülürken
  dikkate alinmalidir.

12
D TIROID HORMON METABOLIZMSININ
DEGERLENDIRILMESI

• D.1 DEIYODINAZLARIN TESPITI, EKSPRESYONU VE
  MIKTARLARININ BELIRLENMESI
• ÖNERI 13
• (a) Deiyodinaz aktiviteleri, kinetik profilleri,
  ve instrinsik özellikleri, (örn Vmax, Km,
  yarilanma aktivitesi, kofaktör sensitivitesi)
  hücre veya doku preperatlarinda tespit
  edilebilir.
• (b) Birden çok deiyodinaz içeren hücre veya doku
  preperatinda deiyodinaz aktivite çalismalari
  yapilabilir, ancak her deiyodinaz aktivitesinin
  bagimsiz olarak ölçülebilmesi için özel kosullar
  saglanmalidir.
• ÖNERI 14
• (a) Optimum substrat ve kofaktör varligi kosulu
  ile herhangi bir deiyodinazin ölçülen Vmax degeri
  belirli bir zamanda hücre veya dokuda bulunan
  fonksiyonel enzim miktarinin yerine
  kullanilabilir.
• (b) Hücre veya dokuda deiyodinaz genlerin
  ekspresyonu mRNA düzeylerinin ölçülmesi ile
  tespit edilebilir.

13
D.2 SAGLAM HÜCRELERDE DEIYODINASYON
D.3 PERFÜZE OLAN ORGANLARDA DEIIYODINASYON

• ÖNERI 15
• Deiyodinasyon yoluyla T4 ve T3 metabolizmasi,
  fizyolojik kofaktörle yapilan çalisma olmasi
  avantaji ile canli hücrelerde ölçülebilir.

• ÖNERI 16
• (a) T4 T3 dönüsümü ve üriner iyodotiriyonin
  ekskresyonu perfüze olan rat böbrek veya
  karaciger preperatlarinda çalisilabilir.
• (b) Plasental iç-halka deiyodinasyonu guinea
  domuz perfüzyon sistemi kullanilarak in situ
  çalisilabilir.

14
D.4 TÜM HAYVANLARDA DEIYODINASYON
D.4 TIROID HORMON METABOLIZMASININ
DEIYODINASYONSUZ YOLAKLARI

• ÖNERI 17
• Toplam vücut deiyodinasyonu canli hayvanlarda
  radio-isaretli 125I-T4 veya 125I-T3 gibi
  iyodotiriyonin uygulamasinin ardindan
  çalisilabilir. Iyodotironinler mini-pompalar
  yoluyla akut olarak veya uzun-dönemli enjekte
  edilebilirler. Bu yaklasim çalismalarin kontrollü
  fizyolojik kondisyonlar altinda yapilmasina
  olanak saglar. Farkli iyodin izotoplari ile
  isaretli birden çok iyodotironin uygulanarak ek
  bilgi elde edilebilir.

• ÖNERI 18
• (a) Sulfotransferaz aktiviteleri ve bunlarin
  intrinsik özellikleri hücre veya doku
  preperatlarinda sulfat donorü olarak
  3'-fosfoadenozin-5'-fosfosülfat (PAPS)
  kullanilarak tespit edilebilir.
• (b) Iyodotironin glukuronidasyon aktiviteleri
  mikrozomal hücre ve doku preperatlarinda,
  kofaktör olarak UDP-glukuronik asid (UDPGA)
  kullanilarak, tespit edilebilir.

15
E. HIPOTIROIDIZM OLUSTURULMASI VE TIROID HORMON
REPLASMANI

• E.1 HAYVANLARDA HIPOTIROIDIZM
• ÖNERI 19
• Hipotiroidizm olusturulurken vücut agirligindaki
  artis monitörize edilmelidir. Deneyler arasinda
  çapraz referans için, vücut agirlik artisinda
  gözlemlenen plato sistemik hipotiroidizm
  durumunun tanimlanmasi adina dikkate alinmalidir.
  T3-duyarli gen ekspresyonu ve enzim aktiviteleri,
  özellikle karaciger D1 ekspresyonu veya
  aktivitesi, tiroid statüsünün ilave ölçümü olarak
  kullanilabilir.
• ÖNERI 20
• (a) Sistemik hipotiroidizm eriskin rat veya
  farede cerrahi total tiroidektomi ile
  olusturulabilir. Sistemik hipotiroidizm
  genellikle cerrahi sonrasi 5-8 haftada gelisir.
  Hemi-tiroidektomize ratlarda sistemik
  hipotiroidizmin daha hafif formu gelisir.
• (b) Sistemik hipotiroidizm antitiroid ilaçlarin
  uygulanmasi sonucu kimyasal tiroidektomi ile de
  olusturulabilir. Hipotiroidizm gelisim süreci
  degisken olup, kullanilan ilaç rejimine baglidir.
  
• (c) Sistemik hipotiroidizm, bezin radyoaktif
  iyotla ablasyonu ile de olusturulabilir. Yetiskin
  hayvanlarda tiroid hormone salinimi 131I
  uygulamasindan 1 hafta sonra belirgin olarak
  azalir. Yenidogan hayvanlarda büyüme 131I
  uygulamasindan 3-4 hafta sonra plato yapar.
• (d) Sistemik hipotiroidizm durumu kombine
  yaklasimlar kullanilarak hizli ve etkin bir
  sekilde elde edilebilir.

16

• ÖNERI 21-23
• Ikincil hipotiroidizm, ratlara cerrahi
  hipofizektomi uygulanarak olusturulabilir.
• Öneri 22 (a) Nkx2.1 (T/ebp, TTF-1) KO faresi
  tiroid disgenezisi için bir modeldir.
• (b) Pax8 KO fare, TSH reseptör KO fare ve
  otozomal-resesif gen hipotiroid (hyt) için
  homozigot olan fare fetal baslangiçli ciddi
  konjenital hipotiroidizm sergiler.
• (c) Dual oksidaz 2 (DUOX2) geninde missense
  mutasyonu olan fare ve Cog fare (konjenital
  guatr) konjenital hipotiroidizmin daha hafif
  modelleridir.
• (d) TRH KO fare tersiyer hipotiroidizm modeli
  olup, tiroid fonksiyonu sadece hafif olarak
  bozulmustur.
• Öneri 23 (a) Deiyodinaz aktiviteleri ile
  iliskili hücre/doku hipotirodizminin özgül
  formlari in vivo olarak D2 yolaginin bozulmasi
  yolu ile veya D3 yolaginin indüksiyonu ile
  çalisilabilir.
• (b) Iyodotironin transportu iliskili hücre/doku
  özgül hipotiroidizm in vivo olarak çesitli
  transport sistemlerinin bozulmasi yoluyla
  çalisilabilir.

17
E.2 HAYVANLARDA TIROID HORMON REPLASMANI

• ÖNERI 24
• (a) Önceden hipotiroid hale getirilmis yetiskin
  ratlarda günlük T4 replasman dozu, büyüme hizi
  ötiroid durumun tanimlanasinda birincil gösterge
  olarak kabul edilecekse, yaklasik günlük üretim
  miktarina benzer olmalidir. Daha yüksek L-T4
  dozlari serum TSHnun normalize olmasi
  gerekliligi halinde kullanilmalidir. Diger tiroid
  hormon sensitif göstergeler dikkate alinacaksa,
  uygun T4 dozu her vakaya özel amprik olarak
  tespti edilmelidir.
• (b) Kemirgenlerde tiroid hormon uygulamasi için
  parenteral yol (örn intra-peritoneal, subkutan)
  osmotik pompalar veya subkutan yerlestirilen
  pompalar araciligiyla tercih edilir.
• (c) Hipotiroid neonatal fareler için T4
  replasmani yasa uygun rejimler ile yapilmalidir.
  
• (d) Fare embriyonik kök-hücreleri fonksiyonel
  tiroidal foliküler hücreye in vitro olarak
  dönüsmek, hipotiroid fareye transplante
  edildiginde sistemik ötiroidizmi saglamak için
  kullanilabilir.

18
E.3 HÜCRE KÜLTÜRÜNDE HIPOTIROIDZM

• ÖNERI 25
• (a) Kültürdeki hücreler, ortama aktif-kömürlü
  serum, resinli serum, hipotiroid hayvandan alinan
  serum eklenerek veya hiç serum eklenmeyerek,
  hipotiroid yapilabilir.
• (b) Kültürdeki hücreler bir TR antagonisti
  kullanilarak hipotiroid yapilabilir.

19
F TIROID HORMON SINYALININ ARTTIRILMASI

• F.1 HAYVANLARDA TIROTOKSIKOZ
• ÖNERI 26
• (a) Akut sistemik tirotoksikoz parenteral (i.p
  veya i.v) yolla 1.0 ug T3/g vücut agirligi (T3ün
  TR-satürasyon dozu) uygulanarak olusturulabilir.
  Genomik etkiler 60 dakika içinde görülebilir ve
  fizyolojik etkiler yaklasik 6 saat içinde baslar.
  
• (b) Uzun dönemli sistemik tirotoksikoz, günler,
  haftalar ve aylarca süren kronik T3 veya T4
  tedavisi ile olusturulabilir. Uygulama yolu
  parenteral veya suyemege katilmak seklinde
  olabilir. Kronik çalismalar için kaseksi ve ölüme
  yol açabilen TR-satüre edici dozlardan
  kaçinilmalidir. Çalismalar arasi
  karsilastirmalara olanak saglanmasi için T3
  dozlari günlük T3 veya T4 replasman dozlarinin
  kati olarak verilmelidir.
• ÖNERI 27
• D2 yolaginin in vivo aktivasyonu veya D3
  yolaginin inaktivasyonu tiroid hormon sinyalinde
  hücre/doku özgül artislarin çalisilmasinda
  kullanilabilir.

20
F.2 HÜCRE KÜLTÜRÜNDE TIROTOKSIKOZ

• ÖNERI 28
• (a) Akut tirotoksikoz hücre kültüründe ortama T3
  eklenmesi yoluyla elde edilebilir. T3ün serbest
  fraksiyonu ile total T3 konsantrasyonunun çarpimi
  serbest hormon konsantrasyonunun tahminini
  saglar. Serbest fraksiyonlar direk olarak tespit
  edilemiyorsa, serbest hormon konsantrasyon
  tahminleri için serbest fraksiyon degerleri ile
  ilgili basilmis yayinlar temel alinir.
• (b) Hücre kültüründe tirotoksikoz olusturulurken
  deiyodinazlarin muhtemel varligi çalisilan her
  hücre tipi için dikkate alinmalidir.

21
F.3 TIROID HORMON ANALOGLARININ KULLANIMI

• ÖNERI 29
• Tiroid hormon sinyali in vivo veya in vitro
  olarak tiroid hormon analoglari ile
  tetiklenebilir. Bunlarin bir kismi
  doku-selektivitesi veya TR isoform
  selektivitesine sahiptir. Bir dizi yüksek
  selektif TR ß analogu, baskin olarak TR ßya
  sahip (örn karaciger veya pitüiter bez gibi)
  dokuyu hedefler. Farkli analoglarin ve T3ün
  ekümolar doz/konsantrasyonlarinin kullanimi
  karsilastirma çalismalarinda baslangiç noktasi
  olarak önerilir.

22
G IYOT EKSIKLIGI VE TIROID HORMONUNUN
MATERNAL-FETAL TRANSFERI

• G.1 KEMIRGENLERDE IYOT EKSIKLIGI
• ÖNERI 30
• (a) Iyot eksikligi durumu, kemirgenleri düsük
  iyotlu diyetle (lt 0.02 ug iyote/g) besleyerek
  olusturulabilir. Iyot eksikliginin daha hafif
  dereceleri diyet degistirilerek elde edilebilir.
  Tiroid ekonomisine etki 10 gün gibi kisa süre
  içinde görülebilirken, çogu parametre için net
  etki en az 1 aylik düsük iyotlu diyete gereksinim
  gösterir.
• (b) Hayvanlarda iyot eksikligi, idrar iyot
  atiliminin (düsük iyotlu diyet alan hayvanlarda
  5-10 kat düsük olmalidir) belgelenmesi ile
  monitörize edilebilir.
• (c) Tiroid içi iyot eksikligi içme suyuna 1lik
  KClO4 tatbikini takiben NIS inhibisyonu yoluyla
  olusturulabilir. Bu yaklasimla tiroid iyot
  depolari 1 hafta içinde tükenir. Daha uzun
  tedavilerin sistemik hipotiroidizme neden olacagi
  hesaba katilmalidir.

23

• ÖNERI 31
• (a) Tiroid bezinin kendisi üzerine iyot
  eksikliginin etkisi, bez boyutunun ölçülmesi (en
  az 2 kat artis görülmeli) ile ve histolojik
  olarak düsük iyotlu diyetin neden oldugu farkli
  derecelerde hiperplazi ve hipertrofi ile
  degerlendirilebilir. Foliküllerdeki kolloid
  miktari azalir ve daralmis foliküler bosluklari
  çevreleyen epitelyal hücreler normal küboidal
  hücreler yerine kolumnar hücrelerden olusur.
• (b) Tiroid ekonomisine iyot eksikliginin etkisi
  serum T4 ve tiroglobulindeki T3/T4 orani
  ölçülerek monitörize edilebilir. TSH artisi erken
  bulgu degildir. Benzer sekilde serum T3 düzeyi
  iyot eksikligi ciddi boyuta ulasincaya kadar
  korunur.
• ÖNERI 32 Gestasyonel veya neonatal iyot
  eksikligi düsük iyotlu diyetle beslenme ile
  olusturulabilir. Kemirgenlerdeki kisa gestasyon
  süresi, annelerin düsük iyotlü diyete önceden
  tabi tutularak gebelik öncesi hipotiroksineminin
  saglanmasini gerektirir.

24
G.2 PLASENTAL TIROID HORMON TRANSFERI

• ÖNERI 33
• Anneden fetüse tiroid hormonlarinin plasental
  transferi MMI-ile tedavi edilmis ve tiroid
  hormonu replase edilmis gebe disilerde fetal
  dokuda T3 ve T4 düzey ölçümü ile çalisilabilir.

25
H TIROID DISI HASTALIK MODELLERI

• ÖNERI 34
• Tiroid disi hastalik modeli olarak açlik, tiroid
  hormonu üretim, metabolizma ve aksiyonuna etkinin
  çalisilmasi için yaygin olarak kullanilan bir
  modeldir.
• ÖNERI 35
• (a) Kemirgenlerde genis cerrahi, yanik,
  inflamatuar agri, bakteriyel enfeksiyon veya
  uzamis immobilizasyon gibi major vücut travmasi
  veya ciddi hastalik tiroid disi hastalik hayvan
  modelleri olarak kullanilabilir.
• (b) Bakteriyel lipopolisakkarid uygulanmasi
  santral hipotiroidzm yaratmak için
  kullanilabilir. Hipotalamik TRH azalarak serum
  tiroid hormon düzeylerinde düsmeye yol açar.

26
I DOKU VE HÜCRESEL DÜZEYDE TIROID HORMON
SINYALININ DEGERLENDIRILMESI

• I.1 TIROID HORMON STATÜ BELIRTECI OLARAK GEN
  EKSPRESYONU
• ÖNERI 36
• T3e doku cevap statüsünün genel degerlendirmesi
  için bilinen cevap genlerinin temsilcilerinin
  analizi aydinlatici veri saglar.
• I.2 mRNA EKSPRESYON DÜZEYLERININ PCR ANALIZI
• ÖNERI 37
• T3-duyarli gen ekspresyonu çalismak için
  seçilecek güncel metod RT-qPCR olup uygun
  valide edilmesi halinde kesin mRNA düzey ölçümü
  saglar. Çalisilan sistem içinde internal kontrol
  genlerinin (örn. referans genler) T3 duyarli
  olmamalari konusunda gereken önlemlerin
  alindigindan emin olunmalidir.

27
I.3 TIROID HORMON-DUYARLI mRNANIN GENOM-WIDE
ANALIZI

• ÖNERI 38
• (a) mRNA ekspresyon paternleri için tüm genom
  taramanin microarray ve diger yöntemleri tiroid
  hormon sinyal yolak manipülasyonlarina cevaben
  olusan gen ekspresyon degisikliklerinin genis
  skala analizinde kullanilabilir. Aday
  transkriptler RT-qPCR, Western blot veya in situ
  hibridizasyon analizi gibi bagimsiz yöntemler ile
  degerlendirilmelidir.
• (b) RNAseq derin-sekanslama teknolojisi kullanir
  ve mikroarray ile karsilastirildiginda daha
  kesin mRNA ve varyant mRNA isoform düzey ölçümü
  saglayabilir.

28
I.4 TIROID HORMONU ILE GEN REGÜLASYON
MEKANIZMASI

• ÖNERI 39
• TRnin hedef gen regülasyonu, röportör gen
  plasmidine ilave TR-ekprese eden plasmid ile
  ko-transfekte olmus doku kültür hücrelerinde
  arastirilabilir. Fizyolojik araligin üzerinde
  farkli dozlarda eklenen T3e cevaben röportörün
  transaktivasyonu degerlendirilir ve cevaplar
  konak hücre özgül faktörlerce etkilenebileceginden
  , farkli hücre dizilerinde test edilebilir.
• ÖNERI 40 (a) Elektroforetik mobilite kayma testi
  (EMSA) TR ile DNA parçasinin direk baglanmasini
  gösterebilir, böylece bir genin TRnin direk
  hedefi oldugu kaniti saglanir. EMSA,
  elektroforeze tabi tutuldugunda protein bagli
  DNAnin, bagli olmayan DNAdan daha yavas hizda
  göç ettigi gözlemine dayanir. DNA unsuru (prob)
  proteinDNA prob komplekslerinin tespitinde
  sensitif olmak için genellikle radyoisaretlidir.
• (b) Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) TRnin
  hedef gen ile doku veya hücre seri genomunda
  dogal kontekste baglandigini göstermekte
  kullanilabilir. ChIPin en kritik ihtiyaci
  immünopresipitasyon için yüksek kalitede özgül
  antikor varligi olup, bu özgüllük kontrol
  deneylerince ortaya konur.
• (c) ChIPin daha ileri uygulamalari çok kompleks
  teknik gerektirir. Bunlar, nükleer faktörün tüm
  genomda baglanma bölgelerini tespit etmekte
  kullanilan ChIP ile microaaray kombinasyonu
  (ChIP-chip) ve yeni jenerasyon sekanslama
  (ChIPseq) analizleridir.

29
I.5 DOKUDA TIROID HORMON VE TR SINYALINI
GÖSTEREN FARE MODELLERI

• ÖNERI 41
• (a) Endojen Thra ve Thrb genlerine hedefli KO ve
  knockin mutasyonu olan fare aileleri in vivo
  olarak TR fonksiyonunun çalisilmasi için model
  saglarlar.
• (b) Bilinen T3 reseptörlerinden (TRa1, TRß1 ve
  TRß2) yoksun olan fareler TR aracilikli
  sinyallerin tam yoklugu için modeli olarak
  kullanilabilirler.
• (c) Hem Thrb ve hem de Thra genlerine uygulanan
  kodlama sekans degisiklikleri tiroid hormon
  rezistansi görülen insan sendromlari için fare
  modeli saglarlar.
• (d) T3-duyarli kimerik protein ekprese eden
  transgenik röportör fareler çesitli dokularda T3
  varligini monitörize etmeye olanak veren in vivo
  model saglarlar.
• (e) Endojen Thra ve Thrb genlerine hedefli
  insersiyonlar protein taglerle birlesmis TR
  proteinleri yaratir, bunlar in vivo olarak özgül
  hücre popülasyonlarinda TR isoform
  ekspresyonlarini monitörize etmekte
  kullanilabilir.

30
J SISTEMIK BIYOLOJIK PARAMETRELER YOLUYLA
TIROID HORMON SINYALLERININ DEGERLENDIRILMESI

• ÖNERI 42
• Kemirgen modelleri tiroid hormonun beyin gelisim
  ve fonksiyonunu nasil etkiledigini çalismak için
  kullanilabilir. Fetal tiroid fonksiyonunun
  baslangiç zamani ile kronolojik yas arasindaki
  korelasyon kemirgenlerde insanlardan farklidir.
  Hayvanin kronolojik yasindan çok nörobiyolojik
  gelisim evresi dikkati alinmalidir.
• ÖNERI 43
• Santral sinir sisteminin fonksiyonel çesitlilik
  ve yapisal karmasikligi bilindiginden, beyinde T3
  duyarli genlerin çalisilmasi in situ
  hibridizasyon veya immunohistokimya yoluyla büyük
  oranda artmistir.
• ÖNERI 44
• (a) Tiroid hormon eksikligine bagli fonksiyonel
  duyma bozukluklari, uyaran yogunluk esiklerinin
  tespiti için auditor evoked beyinkökü cevaplari
  ölçülmek yoluyla çalisilabilir.
• (b) Tiroid hormon eksikligine bagli vizüel
  fonksiyon bozukluklari dalgaboyu sensitivitesi ve
  isik yogunluk esiklerinin tespiti için
  elektroretinogramda vizüel evoked cevaplarin
  ölçülmesi ile çalisilabilir.

31

• ÖNERI 45-48
• Nöron iyon kanallari ve sinir iletimine tiroid
  hormon etkisi yama klemp analizi veya
  mikroelektrot kaydi ile incelenebilir.
• ÖNERI 46 (a)Standardize nörolojik testler tiroid
  hormonunun nöromusküler kontrolü hem motor hem de
  serebeller düzeylerde nasil etkiledigini
  incelemek için kullanilabilir. Tamamlayici
  metodlarin kullanilmasi önerilir.
• (b) Duygudurum, davranis, ögrenme ve hafiza
  tiroid hormonuna duyarlidir ve olusturulmus
  davranissal testler kullanilarak incelenebilir.
  Tamamlayici metodlarin kullanilmasi önerilir.
• ÖNERI 47 Tiroid hormonun davranissal ve
  metabolik parametrelere hipotalamik etkileri
  direk olarak T3ün intra-serebro-ventriküler
  (ICV) uygulanmasi ile çalisilabilir
• ÖNERI 48 (a) In vitro olarak tiroid hormonuna
  cevap veren beyin hücre modelleri santral sinir
  sisteminde T3 etkilerinin incelendigi model
  olarak kullanilabilir.
• (b) In vitro olarak tiroid hormonuna cevap veren
  pitüiter hücre modelleri anterior pitüiter bezde
  T3 etkilerinin incelendigi model olarak
  kullanilabilir.

32
J.2 KALP VE KARDIYOVASKÜLER SISTEM

• ÖNERI 49
• Kardiyak fonksiyon ve morfoloji üzerine tiroid
  hormon etkileri ultrason veya manyetik rözonans
  görüntüleme ile non-invaziv olarak
  degerlendirilebilir.
• ÖNERI 50
• (a) Kalp hizi ve kan basinci üzerine tiroid
  hormone etkisinin analizi serbest dolasan
  hayvanlarda longitüdinal analiz gerektirir.
• (b) Tiroid hormonun sol ventrikül kontraktil
  fonksiyonuna etkisi in vivo olarak sol ventrikül
  basinçlarinin kaydedilmesi ile degerlendirilebilir
  .
• ÖNERI 51
• (a) Kardiyak kontraktil fonksiyon üzerine tiroid
  hormon etkilerinin analizi izole intakt kalp veya
  doku preperatlari kullanan ex-vivo deneylere
  ihtiyaç duyar.
• (b) Tiroid hormonun kardiyak Ca2 homestazina
  etkisi trabekül veya papiller kaslarda
  degerlendirilebilecegi gibi izole tek
  kardiyomiyozitlerde de degerlendirilebilir.

33

• ÖNERI 52-54
• (a) Tiroid hormonuna kardiyak doku yaniti
  histolojik metotlar ve tiroid hormon duyarli gen
  ekspresyon çalismalari yoluyla degerlendirilebilir
  .
• (b) Kontrakte olan miyokard T3 duyarli röportör
  genleri kodlayan plasmid DNAyi alip
  kardiyomiyozit özgül T3 bagimli transkripsiyon
  aktivitesinin in vivo olarak tespitine izin
  verir.
• ÖNERI 53 Rat ve fare kardiyomiyozitlerinin
  primer kültürleri ile birlikte H9C2 hücre serisi,
  tiroid hormon etkisinin çalisilmasinda
  kullanilabilir.
• ÖNERI 54 Vasküler fonksiyon üzerine tiroid
  hormon etkisi arteriyel halkalar ve vasküler düz
  kas hücre kültürlerinde degerlendirilebilir.

34
J.3 INTERMEDIYER METABOLIZMA VE ENERJI
HOMEOSTAZI

• ÖNERI 55
• (a) Ratlarda sistemik tirotoksikoz ve
  hipotiroidizm modelleri olusturulabilir. Dikkate
  alinacak deneysel sonuçlar oksijen tüketimini
  (VO2), solunum oranini (RQ), beslenme
  davranisini, yemek ve su alimini ve
  hareket/aktiviteyi kapsar
• (b) Belirli bir doku üzerine sistemik
  hipotiroidizm veya tirotoksikozun etkisi uygun
  olarak tedavi almis hayvandan izole edilen doku
  veya hücrede çalisilabilir.
• (c) Belirli bir hücrede hücresel enerji tüketimi
  ve metabolik yolaklara tiroid hormonun direk
  etkisinin izole edilmesi için tiroid hormon
  tedavisi uygulanmis hücre kültürleriyle in vitro
  çalismalar yapmak gerekir.
• (d) Izole mitokondri kullanan çalismalar
  mitokondriyal biyolojiye T3 etkisinin
  arastirilmasi için kullanilabilir.
• ÖNERI 56
• (a) Soguk uygulamaya (4-5C) akut veya kronik
  duyarlilik tiroid hormonun termojenik etkilerinin
  çalisilmasi için kullanilabilir.
• (b) Kahverengi adipöz doku termogenezi tiroid
  hormon ile pozitif regüle olur ve rat veya fareye
  adrenerjik agonist infüzyonu esnasinda
  interskapüler BAT (iBAT) yastikçiginda
  çalisilabilir.

35

• ÖNERI 57
• (a) Tiroid hormonun metabolik etkilerinin
  çalisilmasi için termonötral kondisyonlar (örn
  kor isinin zorunlu termogenezis ile saglandigi
  ortam isisi) saglanmalidir.
• (b) Tiroid hormonun termojenik etkisinin
  çalisilmasi için diyetle olusturulan obezite
  modelinde, büyüme hormon salinimi ve lineer
  büyüme, istah, sempatik aktivite ve çevresel
  sicaklik gibi ek tiroid hormon bagimli
  degiskenler mutlaka hesaba katilmaldir.
• ÖNERI 58
• Adipoz dokuda tiroid hormon bagimli metabolik
  olaylar, taze izole beyaz veya kahverengi
  adipozitlerden veya in vitro olarak diferensiye
  edilmis beyaz veya kahverengi adipozitlerden
  hazirlanmis doku preperatlarinda arastirilabilir.
  

36

• ÖNERI 59
• (a)Karacigerde lipogenez ve yag aside
  oksidasyonunun simultane indüksiyonu tiroid
  hormonun önemli etkileridir. Anahtar hiz
  sinirlayici enzimlerin ekspresyonunun çalisilmasi
  kadar bu islemlerin hayvan ve hücre modellerinde
  hizlarinin tahmin edilmesi karacigerde tiroid
  hormon sinyal ebadinin ölçümünde kullanilabilir.
• (b) Serum kolesterol düzeyleri ve karaciger
  kolesterol içerigi karacigere tiroid hormonun
  metabolik etkilerinin biyolojik belirteçleri
  olarak kullanilabilir.

37
J.4 ISKELET KASI

• ÖNERI 60-65
• Tiroid hormonunun kas enerji metabolizmasi ve
  kontraktil özellikleri üzerine etkileri perfüze
  edilen arkabacak preperatlarinda analiz
  edilebilir.
• Kas özelliklerini düzenleyen nöromusküler
  aktivite ile tiroid hormon interaksiyonu kaslarin
  in vivo olarak elektriksel stimülasyonu ile
  çalisilabilir.
• Kontraktil özellikler üzerine tiroid hormon
  etkisi saglam kas ve izole kas liflerinin ex vivo
  analizi ile degerlendirilebilir.
• Tiroid hormonuna iskelet kasi doku yaniti gen
  ekspresyon ve enzim tahlillerinin analizi ile
  degerlendirilebilir.
• Iskelet kasinin lif tipi kompoziasyonuna tiroid
  hormon etkisinin degerlendirilmesi için doku
  kesitlerinin histokimyasal analizi gerekir.
• Iskelet kas hücrelerinin primer kültürleri ve
  çesitli hücre serileri tiroid hormone ile regüle
  olan gen ekspresyonu ve bunun kontraktil aktivite
  ile iliskisinin çalisilmasinda kullanilabilir.

38
J.5 ISKELET

• ÖNERI 66-69
• Postnatal lineer büyüme ve kemik matürasyonuna
  tiroid hormon etkileri en iyi, ex vivo olarak,
  tanimlanan yastaki hayvanlarin harmanlanmis
  örnekleri kullanilarak tespit edilir.
• Tiroid statüsündeki degisiklikler veya tiroid
  hormon etkinligindeki bozulmaya eriskin kemigin
  yapisal ve mineralizasyon cevabi farkli
  rezolüsyon düzeylerinde ilave görüntüleme
  teknikleri kullanilarak degerlendirilebilir.
• Kemik yapi ve mineralizasyonunda tiroid hormonca
  indüklenen degisiklikler, yüklenme halinde
  biyomekanik özelliklerin tespiti yoluyla
  arastirilabilen, fonksiyonel anormallikler olarak
  yansitilir.
• Degisken tiroid statüsüne cevaben kemik
  rezorpsiyon ve formasyonundaki metabolik cevap ve
  degisiklikler indirekt olarak serum
  parametrelerinin ölçümü ile degerlendirilebilir.
• Kemik döngüsü üzerine tiroid hormon etkisi,
  osteoklastik kemik rezorpsiyonu, osteoblastik
  kemik formasyonu veya her ikisinin komibansyonunu
  kapsayabilir. Tiroid hormonuna cevaben kemik
  döngü belirteçlerinin biyokimyasal analizi bu
  belirteçlerin indirek kaba bir degerlendirmesini
  saglarken, bunlar direk olarak kemik dokuda da
  arastirilmalidir.

39

• ÖNERI 70
• (a) Kikirdaga tiroid hormon etki mekanizmalari
  neonatal farelerin kol veya kaburga kafesinden
  hazirlanan kondrosit kültürlerinde çalisilabilir.
  
• (b) Osteoblast kültürleri hücre
  diferensiyasyonuna tiroid hormon etkisinin
  arastirilmasi için kullanilabildigi gibi, in
  vitro olarak fonksiyonel kemik mineralizasyon
  tetkiki olarak ta kullanilabilir. Böyle kültürler
  standart teknikler kullanilarak neonatal fareden
  kalvarianin kollajenaz ile sindirilmesi sonucu
  elde edilir.
• (c) Tiroid hormonunun osteoklastogenezis ve
  fonksiyon üzerine etkileri 6 haftalik farenin
  uzun kemiklerinden hazirlanan osteoklast
  kültürlerinde incelenebilir. Kullanilan
  protokoller in vitro osteoklast formasyonunun
  indüklenmesi için ekstrakte edilen kemik iliginin
  monosit koloni stimulan faktör ve nükleer faktör
  kappa B-ligandinin reseptör aktivatörü ile
  muamele edilmesini içerir.