???????? ? ??? ? ?????? ?????????? ?? ???: ????????????? (STR),

1
???????? ? ??? ? ??????, ?????????? ?? ???

• ?????????? ???????? ??? ????????, ?????? 3
• ???? ?.?.

2

• ???????? ? ??? ? ?????? ?????????? ?? ???
  ????????????? (STR),
• AFLP,
• RAPD,
• PCR-RFLP,
• Inter-SINE PCR ? ?.?.
• ??????? ????????? ?????????. ????????????? ??????
  ???????????? ???????. ?????????????
  ???-???????? ? ????????????? ????????, ?????????
  ???????????? ????????????????? ? ???????????????
  ???????.

3
??????? ???

• ????????????? ????????????? ?????? ??? ?
  ?????????????? ???????????????? ??? ????????? ?
  1971 (!) ?. ?? ?? ????? ?????????? (Kleppe et
  al., 1971)
• ????????? ? 1983 ? ????? ???????? (Kary Mullis,
  (?????????? 1985?).
• ??????????? ?????? ?? ????? 1993 ?.
• ?????? Cetus Corporation, ????? ?????? ?? 300000
  Hoffmann-La Roche. ??????????? ???????? ????????
  ???????, ?????????? ?? ???, ????????????
  ??????????? ? ????? (Du Pont, Promega)
• ?????? ????? ? 2005 ?.!

4
???????????? ?????? ??????? (???)

• ?????????? ???
• ?????
• Mg
• dNTPs (dA, dC, dT, dG)
• Taq-??????????
• ???????? (???? ? ???????)
• ????????????
• ????? ?? 100 ??????? ?? 900 ?? 2000 ???

5
????? ???
6

• ????? ??? ??? ? ?????

7
???????? ???. ????????, ????? ??????
8
???????? ???. ???????????? ??????
9
???????? ???. ???????????? Tetrad Thermal
Cycler (MJ Research PTC-225, USA)
10
???????????? ???-??????????

• Taq-?????????? - Thermus aquaticus
• Pfu-?????????? - Pyrococcus furiosus
• Pwo-??????????- Pyrococcus woesei
• ? ??.
• ? ????? ????? ? ????????? ??????????

11
???????????? ?????? ??????? (???)??????
????????? ??? ???

• ????? ???? ????? ????????? (?????, ??????) -
  ?????? ?????? ????
• - ??????? ????? ??????? ? ??????? ?????????
• - ??????? (???????????)
• - ????????
• - ??? ?????? ?????????
• ????? ???????? ??? ?????, ?? ??????? ?????? (15?
  ???????), ?? ??????? (?) ????????????.
• ?????? ??? ??????????? ??????????? ?? Mg, ??????
  ? ?.?.

12
???????????? ?????? ??????? (???)??????
????????? ??? ???

• ?????? ??? ???
• ?????? (www.sileks.com), ??????? (www.helicon.ru)
  ? ????? ??????
• ???? ??????????? ???????????,
• HotStart ? ?????? ??????????? ????????

13
??????????? ???

• ?????? ??????????? ??????
• ?????????? ?? ?????? (1.0 3.5 mM)
• ???? ?? ???????
• Touch-Down PCR ? ??????? ?????????? t
• ????????? ?????? ? ??????? (?? 2 ?????)
• ?????? ? ???????? ? ? ??????? ?????????? ???
  (????????????? (???. ???????), ????????????,
  ???????????, ????????? ?? ??????? ???????
  ?????????? ? ?.?.)
• ????????????? ?????? ?????????
• Nested PCR

14
??????????? ??? ?????????? ?? Mg. ? ???????????
??????
mfw28
mfw1
mfw31
mfw9
mfw7
mfw31
mfw31
mfw4
mfw16
mfw 1
mfw7
mfw16
mfw4
mfw9

• Adjusted
• Touchdown
• Annealing to
• Mg2
• etc.

Strictly following the protocol in original
publication Grooijmans et. al. 1997
15
??? ??????? ???????? ????

• ?????? ??????? ????????????? ???????? (????
  ?????? ???)
• ??????? ????????????? ???????? (? ????????
  ?????????? ???)
• ???-??????? - ?? ????????? ????????? ???-????????
  ? ????, ??? ?? ????????? ???????
• ????? ???? ????? ????????? ? ?????????, ???????
  ?????? ???? ????? ??????????? (?? ? ????? ???
  ?????? ?????????)
• ??? ???????? ???????? ? ????????? ????????????, ?
  ??????? ?????? ?????????? ???.

16
????????, ?????????? ????????????? (?/???) ?????
PCR ???????
???????? ???? ???????????? ???????????? ???????? ????????
BSA 10 µg/ µl 0.1 µg/ml ???????????? ???????
DMSO 100 2.0-15(?????????? 5) ????????? ?????????????
Glycerol 100 5-20(??????????10-15) ???????????? ????????
Formamid 100 1-5  
Pyrophosphatase thermostable 5 u/µl 0.001-1u/??????? ?????????? ????????????, ??????? ????? ???????? ??????? ?????????????
17
??????? ?? ??? ???????
???????? ????????
??????? ?? ?????? ?? 1.
AcONa (pH 5.0) ???????? ???????????? ???gt5mM.
EDTA ??????????? ? Mg2 ????????????????, ???????? ???????????? ??? gt0.5mM, PCR ?? ???? ??? 1mM.
DEPC ?????????? ???????, ????? ?? ???????????? ? PCR-??????? ????????, ???????????? DEPC.
??????? 10µg/ml - ?? ??????.
??????????? ????????????? ??? ????????????? gt1 (????? ??????? ?????????, ??? ??????).
?????, ??????????? PCR ????? ????????? ???????????? ?????? ????????? ???????????.
NaCl ??????? ?????????? ??? 25mM, PCR ?? ???? ??? 50mM.
???????? ?? ?????? ?? 30.
????? ????????? ????? ??? gt0.2, PCR ?? ???? ??? 0.5
?????? ??? ????????? ??????? - ????????????? ?????? ??? 1, ??? ?????? - ????????????? ??? ????????????? gt1.
18
??????? ?????????? ?? PCR.

• ?????????
• Cresol red 0.2mM
• ????????????? ????? lt20µg/ml
• EtBr 0.1µg/ml
• ????? ????????? ? ??????????? (????????,
  ????????) ????? ????????? ??????????????? ? ???
  ??????? (????

19
???????? ??? ???

• ????? 18-30 ??? ?????????
• GC-?????? 4060 
• ??????? Tm ????????? (??????? ?? ?????, ??? ??
  5 C)
• ??????????? ?????? ????? 55? ? ????? 60? (????
  ????????)
• ?????????? ??????????????? ????????? ???????? 
  ?????? ? ???????
• ??????????, ????? ?? 3-????? ??? ?????? ???
  ???????, ????????? ??? ???????? ??? ??????????
  ????? ? ????????? ???????, ????? ????????????
  ????? ??????????.
• ???? ?????????? ????? ?????????????? ????????
• ??????????? ?????? ?????? ?????? !
• ?? ?????? ???????? ??? ? ??????? ??????
  (????????? ??????????? ??? ???? ???????? ?
  ????????????)

20
???????? ??? ???

• ?????????????
• ????????? ?OI (Folmer et al., 1994
• HCO2198 TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA
• LCO1490 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
• Simon 1991, 1994 universal primers for
  arthropods

21
???????? ??? ???

• ???????? ????? ?????????
• ????????? PrimerSelect (DNASTAR), Oligo
• ?????????? ????? ?????????????????? (???????)
• ?????? ?????????
• ???????? ?? ?????? ? ???????
• ???????? ?? ?????? ????? ??????

22
(No Transcript)
23
?????????? ????????? ??????????? ??????
24
?????????? ????????? ??????? ? ??????
25
?????????? ????????? ?????? ????? ??????
26
???????? ????????? ?? ???????????? ??????? ?
????????? PrimerSelect (DNAStar).
27
Nested PCR (????????? ???)
28
Touch-Down PCR

• ?????????? ??????????? ?????? ?? ?????? ?????
• ????????? ??????? ?????? ?? ?????? ?????
• ?????? ?????????? ????? ? ??????????? ???????
  ?? ?????? ?????

29
Hot-Start PCR

• ?????????? ?????????? ????? ????????????????
  ????????
• ??? ????????? ???????????????? ???????
  ?????????? ??????????????? ?????????? ?????????
  (10-15 ?????)
• ??? ????????????? ??????? ???????????? ?????
  ??????????? ? ????????
• ????????? ???????? ????????? ??????????????
  ?????? ?????????, ???????? ????????????? ???????

30
?????? ??? ???????

• ????????? ????????????
• ???????????? ????????????
• ??????????? ????????????
• ?????
• ????
• ??????
• ???? ???????
• ????????????????