Actividad de los antimicrobianos frente a las biocapas bacterianas

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Actividad de los antimicrobianos frente a las
biocapas bacterianas

• Isabel García Luque
• Departamento de Microbiología
• Universidad de Sevilla

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Infecciones asociadas a dispositivos médicos

• Aumento considerable de dispositivos médicos.
  Alta incidencia de infecciones.
• Infecciones persistentes que responden poco/mal a
  tratamientos convencionales.
• Resistencia/ tolerancia a los antimicrobianos.

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Infecciones asociadas a dispositivos médicos.
Implante nº /año Infecciones Mortalidad
Catéter intravascular 200.000.000 lt0,1-7 15-20
Sonda uretral 5.000.000 5-10
Shunts LCR 80.000 10-15
Marcapasos 60.000 0-3 2
Válvulas protésicas 100.000 1-5 34
Prótesis articulares 350.000 lt1-2 2,5
Implantes dentales 436.000 15
4
Infecciones asociadas a dispositivos médicos
Device Prevalent causative pathogens Prevalent causative pathogens
Device Principal Secondary
Central venous catheters CoNS S. aureus, enterococci, Candida spp., K. pneumoniae, P. aeruginosa.
Urethral catheters E. coli Candida spp., CoNS, E. faecalis, P. mirabilis.
Mecanical heart valves CoNS S. aureus, Streptococcus spp., GNB, enterococci, diptheroids.
Ventricular assist devices CoNS S. aureus, Candida spp., P. aeruginosa.
Coronary stents S. aureus CoNS, P. aeruginosa, Candida spp.
Neurosurgical ventriclar shunts Staphylococci Streptococcus spp., Corynebacterium, GNB.
Peritoneal dialysis catheters S. aureus P. aeruginosa, other Gram-negative spp., Candida spp.,
Orthopedic prostheses Staphylococci S. pneumoniae, Streptococcus spp., P. acnes.
Fracture-fixation devices CoNS S. aureus, Propionibacterium spp., Corynebacterium,
Endotracheal tubes Enteric GNB P. aeruginosa, Streptococcus spp., Staphylococcus spp.
Inflatable penils implants CoNS S. aureus, enteric GNB, P. aeruginosa, Serratia spp., fungi.
Breast implants Staphylococci E. coli, peptostreptococci, C. perfringens, P. acnes.
Cochlear implants S. aureus P. aeruginosa, Streptococcus spp., N. meningitidis, fungi.
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Cómo actuar?

• Retirada/cambio del dispositivo.
• Tratamiento antimicrobiano prolongado a altas
  dosis.
• Reintervención difícil.
• Única opción tratamiento antimicrobiano.
• Costes elevados

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Actividad antimicrobiana biocapas bacterianas

• Huésped
• Microorganismo.
• Antimicrobiano.
• DISPOSITIVO MÉDICO

7
(No Transcript)
8
Biocapas bacterianas
Comunidad de microorganismos, incluidos dentro de
una matriz extracelular, que se encuentran
adheridos a una superficie o en una interfase y
que poseen un estado metabólico diferente del de
las bacterias de vida libre. J.W.Costerton. The
Biofilm Primer
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Formación de las Biocapas. Adherencia

• Fase inicial inespecífica, reversible.
  Interacciones
• a larga distancia (gt150 nm).
• Fuerzas de Van der Waals
• Gravitación
• Interacciones electrostáticas
• Hidrofobicidad

• Enlaces de hidrógeno
• Enlaces covalentes
• Interacciones iónicas
• Hidrofobicidad
• Moléculas bacterianas
• (adhesinas, GPS)

• Fase secundaria específica, irreversible.
  Interacciones
• a corta distancia (lt3 nm).

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Formación de las Biocapas.

• Una vez adheridas, las bacterias comienzan a
  multiplicarse hasta que se desarrolla la biocapa
  madura.

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• La estructura de la biocapa no es homogénea.

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En el proceso de desarrollo de la biocapa, se
establece una comunicación entre las bacterias
(quorum sensing).
Mecanismo bacteriano de comunicación
intercelular controlando la expresión génica en
función de la densidad celular.
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Eficacia de los antimicrobianos frente a las
biocapas bacterianas.

• Penetrar a través de la densa
• matriz de la biocapa.
• Mantener su actividad bactericida
• En las diferentes condiciones
• microambientales.
• Frente a bacterias de crecimiento lento.
• Presentar baja tasa de desarrollo de resistencias

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Resistencia de las biocapas bacterianasa los
antimicrobianos

• Resistencia innata.
• Mecanismos adicionales, diferentes a los de las
  bacterias planctónicas.
• CMB biocapas gtgt CMB planctónicas.
• Las bacterias recuperan rápidamente su
  sensibilidad cuando se liberan de la biocapa.

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Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos
en las biocapas bacterianas

• Inadecuada exposición al antimicrobiano
  (permeabilidad reducida).
• Alteraciones en el metabolismo bacteriano
• Baja tasa de crecimiento
• Heterogeneidad fenotípica
• Resistencia inducida por los biomateriales

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Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos
en las biocapas bacterianas

• Inadecuada exposición al antimicrobiano
  (permeabilidad reducida).
• Pseudomonas aeruginosa alginato- imipenem y
  tobramicina.
• Staphylococcus aureus slime - glicopéptidos.
• Actividad dependiente de la estructura
  /composición química de la biocapa y
  tamaño/composición química del antimicrobiano.

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Estudios de Permeabilidad
1 MH agar. 2,4 Membranas de policarbonato. 3
Biocapas. 5 Disco de antimicrobiano
18
Permeabilidad de CIP, AMC, FOS y SXT en biocapas
de P. aeruginosa y E. coli
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Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos
en las biocapas bacterianas

• Alteraciones en el metabolismo bacteriano
• Tasa de crecimiento reducida
• Pseudomonas aeruginosa /betalactámicos.
• Staphylococcus epidermidis/ ciprofloxacino.
• Diferentes condiciones microambientales
  ácido/básicas, aeróbicas/anaeróbicas
• P. aeruginosa / tobramicina.
• Mecanismos convencionales de resistencia a los
  antimicrobianos.

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Mecanismo de resistencia Especies bacterianas Antimicrobianos
Impermeabilidad de las biocapas a los agentes antimicrobianos P. aeruginosa Aminoglucósidos, Betalactámicos
Impermeabilidad de las biocapas a los agentes antimicrobianos S. epidermidis S. aureus Vancomicina, Teicoplanina
Tasa alterada de crecimiento P. aeruginosa E. coli Betalactámicos
Tasa alterada de crecimiento S. epidermidis S. aureus Fluoroquinolonas
El microambiente de las biocapas afecta a la actividad antibacteriana Característica general de las biocapas Aminoglucósidos, Macrolidos, Tetraciclinas
Mecanismos de resistencia expresados en bacterias planctónicas P. aeruginosa Azitromicina, Betalactámicos, Tobramicina
Elementos genéticos de transferencia horizontal Enterobacteriaceae Betalactámicos, Aminoglucósidos
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Mecanismos de resistencia de las biocapas
bacterianas

• Resistencia inducida por biomateriales
• P. aeruginosa y látex siliconizado
• La actividad de las carbapenemas disminuye en
  presencia de este biomaterial.
• (J Med Microbiol 1997).
• Relacionado con las OMPs (pérdida de oprD2).
• (Antimicrob Agents Chemother. 1999)
• Inducida por el Zn liberado al medio.
• (Antimicrob Agents Chemother. 2003)

22
OMPs de P. aeruginosa Efecto del zinc
MC. Conejo et al. Antimicrob Agents Chemother.
2003
23
CzcCBA Bomba de expulsión responsable de la
co-resistencia a carbapenemas y metales pesados.
Perron K. et al. J Biol Chem 2004 279
8761-8768.
24
Comparison of biofilm-associated cell survival
following in vitro exposure of meticillin-resistan
t Staphylococcus aureus biofilms to the
antibiotics clindamycin, daptomycin, linezolid,
tigecycline and vancomycin. Smith et al. Int
J Antimicrob Agents. 2009
25
Limitaciones estudios in vitro

• Formación proceso complejo
• Muchos factores.
• Difícil reproducir in vitro.
• Resultados controvertidos.
• Cautela a extrapolar in vivo.

26
Métodos de estudio in vitro

• Modelos estáticos
• Formación de las biocapas
• Placas de microdilución.
• Incubación de segmentos.
• Exposición de la biocapa al antimicrobiano
• Ventajas Muchos antimicrobianos, diferentes
  concentraciones.
• Inconvenientes Modelo estático, tiempos cortos,
  poliestireno

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• Efecto de daptomicina sobre la formación de
  biocapas

MRSA
MSSA
gt70
gt75
MRSE
MSSE
70-90
gt90
VISA
80
Roveta et al. Int J Antimicrob Agents 2008
28
Adherencia bacteriana a biomateriales plásticos
Bacterias adheridas x 105/cm2
Catéter S. aureus S. epidermidis E. coli P. aeruginosa
Latex siliconizado 27 3 18 2 19 2 24 3
PVC 42 5 23 3 18 2 41 4
Teflon 11 1 7 0,4 3 0,1 10 1
Poliuretano 15 1 4 0,6 9 0,1 13 1
Vialon 7 1 5 0,3 4 0,2 11 1
López et al. J. Med Microbiol. 1991.
29
Métodos de estudio in vitroModelos dinámicos

• Cultivo continuo. Sistema de flujo laminar.
• Dispositivo de Robbins

30
Modelo dinámico

• Sevilla device
• Cultivo continuo. Sistema de flujo laminar.
• Utilizar segmentos de catéteres.

31
Poliuretano. Biocapas de 24 h
32
Acero inoxidable. Biocapas de 96h.
33
Actividad de antimicrobianos frente a
microorganismos Gram positivos resistentes
34
Daptomicina / Biometales

• Cepas
• Staphylococcus epidermidis ATCC 35984 (ica
  productora de slime).
• CMI
• Daptomicina 0.5 mg/L
• Vancomicina 2.0 mg/L
• Biomateriales
• Segmentos de catéteres de poliuretano (3 cm 7
  french).
• Discos de acero inoxidable 316L (diámetro 8 mm).

35
Poliuretano. Biocapas de 24 h


plt0.05 comparada con vancomicina
36
Acero inoxidable. Biocapas de 96h.



plt0.05 comparada con Vancomicina
37
Figura 2. Microscopía electrónica de barrido de
las biocapas de 72 horas de S. epidermidis sobre
catéteres de poliuretano usando el dispositivo
diseñado por nuestro grupo sin antimicrobiano (a)
y expuesto a 7.5mg/L de daptomicina
(b)a) b)
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Linezolid / Biometales

• Actividad comparativa de linezolid y vancomicina
  frente biocapas bacterianas de 96 horas sobre
  acero inoxidable a distintos tiempos.

39
Linezolid / Biometales

Actividad de linezolid y vancomicina asociados a
rifampicina frente biocapas bacterianas de 96
horas sobre acero inoxidable a distintos tiempos.
40
Nuevas estrategias frente a las biocapas
bacterianas

• Impedir la formación de la biocapa
• Bloqueando la adherencia
• Biomateriales impregnados con biocidas o
  antimicrobianos.
• Moléculas antisentido que silencien los genes
  involucrados en la adherencia
• Inhibidores del quorum
• sensing.

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Nuevas estrategias terapéuticas frente a las
biocapas bacterianas

• Eliminar la biocapa formada
• Métodos físicos corriente eléctrica de baja
  intensidad, ultrasonidos
• Terapia fotodinámica (PDT)

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Efecto del tiempo de incubación con hipericina en
la actividad fotodinámica antimicrobiana frente a
biocapas estafilocócicas.Sofía Ballesta1,
Isabel García1, Yolanda Gilaberte2, Antonio
Rezusta3, Álvaro Pascual1,4.Departamento de
Microbiología, Facultad de Medicina. Universidad
de Sevilla1. Unidad de Dermatología, Hospital San
Jorge, Huesca2. Departamento de Microbiología,
Hospital Universitario Miguel Servet. Universidad
de Zaragoza. Zaragoza3. Unidad de Enfermedades
Infecciosas y Microbiología Clínica. Hospital
Universitario Virgen Macarena. Sevilla4.

• Material y métodos
• Cepas
• S. aureus ATCC 29213 y ATCC 33591 (productora y
  no productora de slime)
• S. epidermidis ATCC 35984 (productora de slime).
• Actividad de hipericina (0.04-500 uM)
• Bacterias en suspensión 5 min de preincubación y
  dosis de luz de 8 J/cm2 (lámpara LED 60210 nm
  intensidad 24 mW/cm2, 10 min tto).
• Biocapas de 24 horas formadas sobre placas
• de poliestireno
• Diferentes tiempos de preincubación
• 30 J/cm2 (30 min tto)

43
Resultados
Bacterias en suspensión Preincubación 5
minutos. Dosis de luz 8 J/ cm2

• Cinco minutos de preincubación con hipericina 1µM
  fueron suficientes para eliminar los
  estafilococos en suspensión.

44
Resultados
Biocapas estafilocócicas Preincubación 5
minutos. Dosis de luz 8 J/ cm2
45
(No Transcript)
46
Conclusiones

• Hipericina mostró un efecto bactericida
  dosis-dependiente frente a las biocapas de S.
  aureus y S. epidermidis.
• La actividad de Hiperericina frente a las
  biocapas de S. aureus y S. epidermidis fue tiempo
  de preincubación y concentración dependientes
• La reducción en la supervivencia bacteriana fue
  menor en la cepa de S. aureus productora de slime
  que en la no productora.
• El efecto de la hipericina sobre las biocapas de
  S. epidermidis fue similar al observado en las
  biocapas de S .aureus no productor de slime.

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Actividad fotodinámica de hipericina asociada a
antimicrobianos frente a biocapas de
Staphylococcus aureus

• Cepas S. aureus ATCC 29213 y ATCC 33591
  (productora y no productora de slime)
• Preincubación de las biocapas de 24 horas
  formadas sobre placas de poliestireno con
  hipericina (0.125-250 µM)
• Dosis de luz 30 J/cm2 (lámpara LED 60210 nm
  intensidad 24 mW/cm2, 30 min tto).
• Incubación durante 24 h con
• 10mg/L Linezolid/- 3 mg/L Rifampicina

48
(No Transcript)
49
(No Transcript)
50
Conclusiones

• La actividad fotodinámica de hipericina fue
  similar a la mostrada por linezolid solo o
  asociado a rifampicina frente a biocapas de S.
  aureus.
• La actividad de hipericina asociada a linezolid o
  a linezolid más rifampicina fue mayor que la
  mostrada por hipericina sola.

51
Actividad fotodinámica de hipericina frente a
cepas clínicas de Staphylococcus aureus
Bacterias en suspensión
Supervivencia SAMR SAMS
bacteriana 11 cepas 11 cepas
REDUCCIÓN 0,12 µM 0,12 µM
3 LOG 0,12 µM 0,12 µM
REDUCCIÓN 0,12 µM 0,25 µM
TOTAL 0,12 µM 0,25 µM
52
Biocapas
  Supervivencia bacteriana Supervivencia bacteriana
HYP REDUCCION LOG REDUCCION LOG
µM MR MS
2 1,08 0,35 1,05 0,27
4 1,30 0,31 1,09 0,30
8 1,49 0,42 1,26 0,28
16 1,79 0,47 1,20 0,30