PREPARATE MICROSCOPICE

1
PREPARATE MICROSCOPICE

• CATEDRA DE MICROBIOLOGIE
• LP 3

2
COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA ZIEHL - NEELSEN

• INDICATII
• - colorarea la cald a micobacteriilor din
  prelevate patologice sau culturi

3
COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA ZIEHL - NEELSEN

• Reactivi
• Solutie de fucsina fenicata Ziehl
• Solutie decoloranta amestec acid alcool (H2SO4
  alcool etilic 95)
• Solutie recoloranta albastru de metilen

4
COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA ZIEHL - NEELSEN

• Procedura
• Se aseaza lama cu frotiul fixat pe un suport
  metalic
• Se acopera frotiul din abundenta cu sol. de
  fucsina fenicata
• Se lasa 15, timp in care se fac 3 treceri cu
  flacara becului de gaz Bünsen pe sub lama de
  sticla, astfel incat sa incalzim colorantul pana
  la emitere de vapori.

5
COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA ZIEHL - NEELSEN

• Atentie! Colorantul nu trebuie sa ajunga la
  fierbere!
• Daca colorantul se evapora sau se usuca pe lama,
  trebuie sa adaugam colorant proaspat!
• 4. Se spala frotiul din abundenta cu apa de
  robinet

6
COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA ZIEHL - NEELSEN

• 5. Se decoloreaza frotiul cu amestec acid
  alcool 2
• 6. Se spala cu apa de robinet
• 7. Recolorare cu sol. albastru de metilen 1

7
COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA ZIEHL - NEELSEN

• Citire si interpretare
• - bacilii acido alcoolo - rezistenti (BAAR)
• apar rosii stralucitori
• celulele inflamatorii, celulele de
• descuamare sau celulele tisulare, bacteriile
• neacido alcoolo rezistente se vor
• colora in nuante de albastru

8
COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA KINYOUN

• INDICATII
• Coloratie la rece a micobacteriilor din
  prelevate patologice sau culturi

9
COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA KINYOUN

• Reactivi
• A. Solutie de fucsina fenicata Kinyoun
• B. Solutie decoloranta de acid alcool
• (HCl alcool etilic 95)
• C. Solutie recoloranta albastru de metilen

10
COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA KINYOUN

• Procedura
• Colorare la rece cu sol. de fucsina fenicata
  Kinyoun 5
• Spalare cu apa de robinet
• Decolorare cu amestec acid alcool 30
• Spalare cu apa de robinet
• Recolorare cu albastru de metilen 1
• Spalare cu apa de robinet.

11
COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA KINYOUN

• Citire si interpretare
• - bacilii acido alcoolo - rezistenti (BAAR)
• apar rosii stralucitori
• celulele inflamatorii, celulele de
• descuamare sau celulele tisulare, bacteriile
• neacido alcoolo rezistente se vor
• colora in nuante de albastru

12
COLORATII SIMPLE

• Coloratia cu albastru de metilen 2
• Coloratia cu albastru de metilen, varianta
  Wayson 10

13
COLORATII NEGATIVE

• Coloratia negativa cu tus de India
• Principiu
• particulele colorate nu pot penetra capsula
  bacteriilor sau levurilor, care apare necolorata
  pe fondul colorat al preparatului
• Indicatii
• depistarea Cryptococcus neoformans,
  depistarea capsulei bacteriene in primoculturi,
  urmarirea reactiei de umflare a capsulei etc.

14
COLORATII NEGATIVE

• Citire si interpretare
• Bacteriile si levurile capsulate apar
  inconjurate cu un halou clar pe fondul uniform
  intunecat al preparatului.

15
COLORATII NEGATIVE

• 2. Coloratia negativa cu nigrozina

16
COLORATII FLUORESCENTE

• Coloratia cu auramina rhodamina
• Principiu
• Structuri speciale, lipoidice, asociate
  peretelui unor bacterii confera rezistenta la
  decolorarea protoplastului prin solutii de acizi
  sau/si alcool. Bacteriile care nu poseda asemenea
  structuri sunt decolorate si trebuie recolorate
  pentru a putea fi observate.
• Endosporii bacterieni, ascosporii, chistele
  unor protozoare (ex. Cryptosporidium) sunt de
  asemenea acidorezistenti gratie invelisurilor
  lor.

17
COLORATII FLUORESCENTE

• Invelisurile unor microorganisme
  (micobacterii,endospori, chiste de
  Cryptosporidium etc.) sunt impermeabile si pentru
  colorant, care trebuie sa actioneze in solutii
  concentrate fie la cald, fie in prezenta unor
  detergenti.

18
COLORATII FLUORESCENTE

• Indicatii
• Triajul frotiurilor din prelevate patologice
• pentru depistarea rapida a bacililor
• tuberculozei.

19
COLORATII FLUORESCENTE

• Reactivi
• Solutie coloranta cu Auramina O Rhodamina B
• Solutie decoloranta (HCl conc. alcool etilic
  95)
• Contracolorant KMnO4

20
COLORATII FLUORESCENTE

• Procedura
• Colorare cu sol. Auramina O Rhodamina B 15
• Spalare cu apa de robinet
• Decolorare cu acid alcool 2
• Spalare cu apa de robinet
• Contracolorare cu KMnO4 2
• Spalare cu apa de robinet

21
COLORATII FLUORESCENTE

• Examinare la microscopul cu fluorescenta cu
  obiectivele de 20x si 40x, asociate cu oculare de
  10x.

22
COLORATII FLUORESCENTE

• Citire si interpretare
• Bacilii acido alcoolo rezistenti se
  coloreaza fluorescent stralucitor in galben
  portocaliu cu Auramina O Rhodamina B.
• Contracolorarea cu KMnO4 face fondul
  frotiului negru eventual numai cu resturi
  celulare cu fluorescenta galbena slaba.

23
ALTE TIPURI DE COLORATII

1. Coloratia May Grünwald Giemsa (aprecierea
   celularitatii)
2. Coloratia pentru Fe. (hemosiderina, sangerari
   tisulare)
3. Coloratia PAS (depistarea fungilor se coloreaza
   in rosu)
4. Coloratia cu albastru de toluidina (pentru
   Pneumocystis carinii, P.jirovecii)

24
ALTE TIPURI DE COLORATII

• 5. Coloratia cu SUDAN III pentru lipide
• 6. Coloratii imunocitochimice, reactii peroxidaza
  antiperoxidaza
• etc.