Biol

1
Biológiai diverzitásMetagenom analizis
2
Biodiverzitás

• Bár a mikrobák központi szerepet játszanak a
  biotikus folyamatokban, nagyon keveset tudunk
  valós sokféleségükrol
• Mikrobiális diverzitás, katabolikus gének
• Szaporítható/nem szaporítható mikroorganizmusok
• Környezeti metagenom könyvtár

3
A Földön eloforduló fajok becsült száma

• Jelenleg kb 5000 prokarióta fajt ismerünk, de a
  becsült számuk több, mint 1 000 000!
• A molekuláris technikák fejlodésével új
  lehetoségek
• A laborban nem szaporítható prokarióták genetikai
  és biotechnológiai jelentosége hatalmas

A Földön eloforduló fajok becsült száma
Ismert, leírt fajok száma (x1000)
becsült fajok száma (x1000)
ismert fajok
4
Miért fontos, hogy megismerjük a leheto legtöbb
mikróba fajt?

• Alapveto szerepet játszottak a bioszféra
  kialakulásában
• Meglepoen nagy fiziológiai, biokémiai
  változatosságot mutatnak
• Képesek extrém körülmények között élni
• Tanulmányok arra világítanak rá, hogy a
  prokarióták száma jelentosen meghaladja az
  eukarióta sejtszámot, sot egyes becslések szerint
  a prokarióta összbiomassza is meghaladja az
  eukarióta összbiomassza tömegét
• A fentiek ellenére kevés ismerettel rendelkezünk,
  mivel az össz prokarióta féleségnek csak kis -át
  tudjuk laboratóriumi körülmények között
  szaporítani, így érthetoen nem is lehet elegendo
  információt szerezni a fajok többségérol
• A különbözo élohelyek mikrobiális sokféleségét
  akkor tudjuk analizálni, ha a teljes genetikai
  anyagot kinyerjük a vizsgálandó élohelyrol
  gyujtött mintából (metagenom)

5
Metagenomika

• A genomika egy szervezet teljes genetikai
  állományát határozza meg, a metagenomika pedig
  egy adott (mikro-) környezetben élo közösség
  teljes genetikai anyagát
• Hagyományosan laborban szaporított, tiszta
  kultúrákat vizsg, viszont sok mikroorganizmus nem
  szaporítható, ami gátat szab a megismerésnek. A
  metagenomika a közösség összetételén túl a
  funkcionális (metabolikus) potenciáljára is
  szolgáltat információt
• A legvizsgáltabb/legkedveltebb a tengeri
  környezet. Emellett a talaj metagenom a
  legfontosabb diverzitás szempontjából

6
Talaj metagenom

• A talaj nagyon összetett élohely
• A mikrobiális heterogenitás a talajban felülmúl
  minden más környezetet kimutatták, hogy 1 g
  talaj több ezer faj akár 10 milliárd egyedét is
  tartalmazhatja!
• A mikrokörnyezet jelentosen befolyásolja a sejtek
  szaporodását, aktivitását, így két egészen közeli
  mikrokörnyezet is nagyon eltérhet egymástól. Ez a
  heterogenitás eredményezi a mikrobiális élohelyek
  nagy változatosságát és a mikrobák sokféleségét
• Jogos tehát a várakozás, hogy a talaj metagenom
  genetikai sokfélesége még tartogat
  meglepetéseket, és gazdag forrása lehet ipari
  jelentoségu enzimek, bioaktív anyagok
  felfedezésének

7
DNS kinyerése a környezeti mintából

• Molekuláris ökológiai tanulmányok szerint a
  standard kultivációs technikákkal a mikrobiális
  diverzitás max 1-a nyerheto vissza, noha pl.
  talajban akár több, mint 10 000 különbözo faj is
  jelen lehet (Komoly problémát jelent, hogy az in
  situ megfigyelheto mikróba sokféleség, és a
  szaporító tápon in vitro számolható telepszámok
  (számlálási anomáliák) között eltérés mutatkozik)
• Pace és mtsai úttöro szerepet játszottak a
  metagenom extrakciója környezeti mintából
  kifejlesztésében. (Az extrahált DNS egyveleget
  részlegesen emésztették, a fragmenteket l
  vektorba ligálták, E. coli-ba klónozták, és az
  rRNS-ket kódoló géneket vizsg, mely segíts-vel
  nemszaporítható egyedek létezésérol is nyerünk
  információt)
• A talaj a legjobb környezet a mikrobiális
  sokféleség vizsgálatára, de komoly hátránya, hogy
  a DNS kinyerése során huminsavak is
  extrahálódnak, melyek gátolják a molekuláris
  munkákat

8
DNS kinyerése a környezeti mintából

• A DNS kinyerésére mátrix gazdag (talaj, üledék)
  környezeti mintából kétféle extrakciós módszert
  dolgoztak ki
• A sejtek direkt lizise, és ezáltal a DNS
  közvetlen kinyerése - a környezeti mintától nem
  választjuk el a sejteket. Sok DNS-t nyerünk,
  egyszeru extrakciós eljárás
• Indirekt módszer eloször elválasztjuk a környezo
  anyagoktól a sejteket, és utána extaháljuk a
  DNS-t a tisztított (utána akár laborban
  felszaporított) sejteketbol - tiszta, nagyon jó
  integritású DNS
• Attól függoen, hogy mi a célunk használhatjuk a
  két módszer egyikét, pl. egy egyedi enzimet
  kódoló gén kinyeréséhez alkalmazható az elso
  megoldás, míg multifunkciós enzimeket kódoló
  géncsoportok izolálásához célszeru a második
  módszert használni

9
(No Transcript)
10
DNS extrakciós módszerek összehasonlítása

• Indirekt módszer (közvetett)
• eloször elválasztjuk a környezeti minta
  anyagaitól a sejteket (ezután gyakran
  felszaporítjuk), és utána extraháljuk a DNS-t
• a jelenlévo mikróbáknak csak egy részét lehet
  szelektálni és szaporítani tiszta kultúrában. A
  szaporítható mikroorg-k jellemezhetok,
  fermentálhatók
• Tiszta, nagyon jó integritású DNS nyerheto
• Olyan talajminták esetén elonyös, ahol nagy
  mennyiségu olyan anyagot találunk, amelyek
  zavarják a DNS izolációt (pl. huminsavak)
• Nagyobb DNS fragmentek,nagy-inszert könyvtár
  készítésére alkalmas

• Közvetlen lizis
• Az adott környezet összes mikroorg-nak teljes
  genomját izoláljuk és klónozzuk egy gazdába (pl.
  E. coli) a további vizsgálatokhoz
• A sejteket nem választjuk el a környezeti
  mintából, lízisüket a DNS tisztítása követi
• A sejtek lizisére magas homér-sékletet, eros
  detergenseket, mechanikai törést vagy
  fagyasztás-olvasztás módszert alkalmazhatunk
• Jobban reprezentálja a minta valós mikrobiális
  sokféleségét
• Leggyakrabban ezt használják, mivel sokféle
  talajra alkalmaz-ható, kevésbé laborigényes, több
  DNS nyerheto
• Hátránya kisebb DNS fragmentek keletkeznek

11
DNS kinyerése a környezeti mintából

• A genetikai anyag önmagában nem elegendo a
  mikrobiális környezet megismeréséhez, minket
  elsosorban az érdekel, hogy
• mit tudnak
• milyen fontos tulajdonságot hordoznak számunkra
  és a környezet számára
• milyen funkcionális fehérjéik, egyéb molekuláik
  vannak
• ezen tulajdonságokhoz, fehérjékhez, egyéb sejt
  által termelt anyagokhoz hogyan juthatunk hozzá

12
Metagenom analizis

• Az a felismerés, hogy a környezetben élo
  mikroorganizmusok többsége nem szaporítható
  standard módszerekkel, ösztönzoleg hatott a
  metagenomika fejlodésére, melyet úgy
  definiálhatunk, hogy a mikroorganizmusok
  szaporítása nélküli genom analizis
• Két típusa
• Funkció alapú analizis a kifejezodo
  tulajdonságokat keressük, vizsgáljuk
• Szekvencia alapú analizis a könyvtárat egyedi
  szekvenciák keresésével hozzák létre

13
Metagenom analízis
14
Metagenom analizis

• Amikor egy környezeti mintából kifejezetten egy
  bizonyos funkciót szeretnénk megtalálni, egy
  bizonyos enzim aktivitását kimutatni, nyomon
  követni több megközelítés lehetséges
• Bróm jelölt uracil használata, mely a
  metabolikusan aktív sejtek RNS-eibe épül be
• Izotóp jelölt szubsztrátot alkalmazunk, mely a
  metabolikusan aktív sejtek szervesanyagaiban
  jelenik meg
• A környezeti mintából kinyert DNS szakaszokat
  vektorba építve, pl. E. coli sejteket használva,
  azok a sejtek tudnak szaporodni, melyek a
  szubsztrát bontásáért felelos géneket/
  tulajdonságokat hordozzák
• Számos egyéb lehetoség is létezik

15
Specifikus (egy bizonyos funkcióért felelos!) DNS
szakaszok dúsítása környezeti mintából
16
Transzkripció/transzláció (elozo ábra a, és b,
példájához)
17
Mikroorganizmusok és lebontási útvonalak
tervezése hatékonyabb biodegradáció elérése
céljából
18
Miért keresünk új megoldásokat?

• Mindamellett, hogy számos természetesen
  eloforduló mikroorg-al találkozunk, melyek
  képesek a xenobiotikus komponenseket bontani,
  vannak korlátai is e folyamatoknak
• Nincs olyan egyedi mikroba, mely képes minden
  szerves hulladékot bontani
• Nagy konc-ban a szennyezoa gátolhatja a
  szaporodást és/vagy metabolikus aktivitást
• Összetett szennyezések esetén, noha több
  komponenst képes bontani egy mikroba, van egy,
  mely gátolja aktivitását
• Nem poláris komponensek szorbeálódnak a talaj-,
  üledék részecskéihez, kevésbé hozzáférhetové
  válnak
• Gyakran lassú a biodegradáció
• Lehetoség pl plazmid transzfer, gén módosítás
  segítségével jobb metabolikus tulajdonságokkal
  bíró törzsek létrehozása

19
Plazmid transzfer

1. Kromoszóma
2. plazmid

Description  This image is a line drawing of
bacterial conjugation. The image shows, going
from the top to the bottom, two bacteria before,
during, and after conjugation. On the top then
are two bacterium, before conjugation, each with
their own chromosomal DNA. Only one bacterium
shows a plasmid. In the middle, are the same two
bacterium during conjugation. A pilius
(connection) forms between the two bacteria and a
linear copy of the plasmid is transported through
the pilius to the other bacterium. On the bottom,
are the same two bacterium after conjugation. The
pilius is now gone and each bacterium has a
plasmid.
20
Manipuláció plazmid transzfer segítségével
Inkompatibilitás lehet a plazmidok között (azonos
v hasonló replikációs origó gének), ekkor nem
maradnak fenn egy sejtben együtt Egy szénhidrogén
bontó baktérium törzset (strain C) használtak fel
(szabadalom)
21
Manipuláció plazmid transzfer segítségével

• Eleinte mezofil mikroorganizmusokkal végezték
  csak
• Probléma a környezetben sokkal általánosabb a
  0-20C (vizek, talaj)
• Pszikrofilekbe (hideg kedvelok) kell az
  információkat (plazmid) juttatni, melyek az adott
  környezeti feltételeket jól turik

22
Manipuláció génmódosítással

• Egyes folyamatokban a keletkezo intermedierek
  gátolhatják a következo átalakítási lépéshez
  szükséges enzimek szintézisét, ezen lehet néha
  változtatni
• Kometabolizmus esetén a bontandó anyag nem
  szubsztrátja a sejtnek, így nem indítja el a
  bontáshoz szükséges enzimek szintézisét, ezen
  szintén lehet módosítani

23
Manipuláció génmódosítással

• Pseudomonas putida törzs pWWO plazmidja xilol és
  toluol bontásáért felelos enzimeket kódoló
  géneket hordozó plazmid
• xyl operon a Pm promoter szabályozása alatt áll,
  melyet a xylS gén terméke pozitívan szabályoz
  (ami önálló promoterrel rendelk) és a legtöbb
  szubsztrát (benzol szárm) aktiválja
• A pWWO-t hordozó bakt át tudja alakítani a
  4-etilbenzoátot (4EB) 4-etilkatekollá (4EC), de
  tovább nem, mert az inaktiválja a xylE gén
  termékét a katekol 2,3-dioxigenázt.A 4EB pedig
  nem aktiválja axylS fehérje term-t
• Kérdés hogyan lehet a 4EB-tinducerré
  (szubsztráttá) tenni, és elérni, hogy a 4EC
  negátolja a katekol 2,3-doxigenázt

24
példa
Mutagenizálás után 4EB jelenlétében átírodott a
xylS gén terméke
Tetr tetracyclin rezisztencia gén Ampr
ampicillin rezisztencia gén Kanr kanamycin
rezisztencia gén
Mutagenizálták etil-metánszulfonáttal
25
A mutagenizált xylS gént egy széles
gazdaspektrumú kanamycin rezisztens plazmidba
építették, és a pWWO-t hordozó P. putida-ba
juttatták A sejteket nagy mennyiségben 4EB
szénforráson, kanamycin és etil-metánszulfonát
jelenlétében inkubálták Csak azok a sejtek tudtak
szaporodni, melyek esetében a keletk 4EC nem
gátolta a katekol 2,3-dioxigenáz enzim
aktivitását (ezekben a sejtekben az enzimet
kódoló gén xylE- mutálódott)
26
Manipuláció génmódosítással

• TCE széles körben használt oldószer, gyakori
  talaj, talajvíz szennyezo, perzisztens,
  potenciális karcinogén. Gyakran vinilkloriddá
  alakul anaerob talajbaktériumoknak köszönhetoen
• Ennek környezetbarát eltávolítására is célszeru
  jó megoldást keresni
• Lehetséges jelölt aromásokat bontó P. putida,
  mely képes a TCE-t is bontani. A felelos enzim a
  toluol dioxigenáz, melynek szintéziséért 4 gén
  felelos.
• A 4 gént E. coli-ba vitték, megfelelo promoter
  rendszerben ezek kifejezodtek, és nem káros
  anyaggá alakították a TCE-t. Kezdeti hatékonysága
  elmaradt a P. putida-étól, de sokkal hosszabb
  ideig aktív maradt. A TCE-re ellentétben a P.
  putida-val - nem érzékeny az E. coli
• Ennek több verzióját is létrehozták P.
  putida-ban, bifenil dioxigenáz gént juttatak be,
  és az így létrehozott törzs ellenállóbb volt, sot
  sokkal több szubsztrátot képes volt átalakítani

27
összefoglalás

• Nagyon sokféle megoldás létezik, a plazmidok
  segítségével számtalan lehetoség áll
  rendelkezésünkre, hogy megváltoztassuk egy törzs
  képességeit
• De vigyázni kell, hogy az új tulajdonságok
  bevitelével ne borítsuk fel a mikroba alapveto
  funkcióit
• Két (esetleg több) alternatív lebontási útvonal
  is lehet aktív egy törzsben, de pl. egyszerre
  orto-hasítási és meta-hasítási (dioxigenázok)
  útvonal nem muködoképes, hiszen összekutyulódik a
  folyamat, és használhatatlan köztitermékkel be is
  fejezodik a lebontás, és a sejtek elpusztulnak
• Rezisztenciát hordozó törzseket nem lehet
  kijuttatni a természetbe!

28
Általánosan használt technikák a molekuláris
mikrobiális ökológiában