BAKTERIJU GENETISKA ANALIZE

1
BAKTERIJU GENETISKA ANALIZE
2
No 1944. lidz 1952. gadam bakterijam tika
atrasti 3 galvenie procesi, kas noveda pie
genetiska materiala apvienošanas un
rekombinacijas
transformacija
konjugacija,
transdukcija
Šis visas tris bakteriju hibridizacijas spejas
izmanto genetiskaja analize atkariba no
eksperimentetaja uzstaditiem merkiem.
3
Bakteriju transformacija - ta ir tadas DNS
parnese, kas izoleta no citam šunam.
Transformacija DNS, kas izdalita no kada celma
šunam ( donori ), uznem cita celma šunas
(recipienti).
Par to vai transformacija ir notikusi var spriest
pec recipienta izmainita fenotipa.
4
Transdukcija - bakteriju genu parnešana un
rekombinacija ar bakteriofaga starpniecibu.
Procesu,kura genetiska informacija pariet no
vienas bakterijas uz otru, pastavot šunu
kontaktam, nosauca par konjugaciju
5
(No Transcript)
6
Bakteriju zigota vienmer ir bijusi daleja
zigota jeb
merozigota.
7
Konjugacijas laika recipienta šuna ieiet mazak ka
½ bakterijas genoma un loti reti - viss genoms (
4 x 10 6)
Transdukcija parnesama fragmenta lielumu nosaka
bakteriofaga apvalka lielums, bet parnesamais
fragments neparsniedz 1/100 E.coli hromosomas
garuma (3,2?104 b.p.).
Transformacija parnesama fragmenta hromosomas
lielums - 1,5 - 20?103 b.p.
8
Genetiskas analizes konkretos uzdevumus dikte
noteiktas metodes izvele genetiska materiala
ievadišanai šuna.
9
Ta, piemeram, partraukta konjugacija lauj noteikt
genu secibu hromosoma. Tomer ši metode nav erta
kartešanai markieriem, kas atdala karte 1 lidz 2
min.
Šajos gadijumos nepieciešama kartešana pec trim
punktiem, kuru veic pamatojoties uz konjugaciju,
gan uz transdukciju vai tranformaciju.
Uz šo principu pamata ir uzbuvetas bakteriju
kartes.
10
Bakteriju karšu ipatniba - cieša saite starp
geniem un tuvas konstrukciju organizacijas
triptofana, biotina, cistidina sinteze, glikozes,
arabinozes izmantošana u.c.
Šo genu punkti jeb klasteri atspogulo bakteriju
genetiskas organizacijas supresoro momentu un ir
saistiti ar speju regulet genu darbibu ( klasisks
piemers - E.coli laktozes operons).
11
Konjugacija
12
1946. Gada Dž.Ledenberg un E. Teitums atklaj
konjugacijas procesu E. coli bakterijam uz
genetiskas pieejas pamata.
13
Kopa kultivejot divus auksotrofus E.coli celmus
met bio
thr leu
Ar biezumu 1.10 -6 veidojas prototrofas
bakterijas.
Ja spontano mutaciju videjais biežums 10 -6, tad
diviem iezimetajgeniem spontano reversiju
biežums bus
10 -6 x 10 -6 10 -12
Acimredzot starp abiem celmiem ir notikusi
genetiska materiala apmaina.
14
Talakie petijumi radija, ka genu apmaina notiek
tikai tad, ja bakterijas kontakte viena ar otru.
DNS parnes tikai viena virziena, no donora uz
recipientu.
Donora ipašibas ir saistamas ar fertilitates ( F
) faktora klatbutni viriškaja bakterija.
15
Dzimumdiferenciacijas kontrole

F
F
-
Hfr
1952. gada V. Heiss paradija, ka F- faktors ir
plazmida.
F faktor E.coli šuna var eksistet divos stavoklos
ka autonoma plazmida ( F ) vai ari ka
bakterijas hromosoma integreta DNS molekula ( Hfr
).
Šadas plazmidas sauc par episomam.
16
Rekombinanti,kas paradas
F- x F krustošana
ir rezultats F- šunu konjugacijai ar Hfr šunam,
kuras paretam rodas F šunu kultura.
17
(No Transcript)
18
(No Transcript)
19
F vienpavediena parravums tiek izdarits vieta,
kas nesakrit ar F faktora parasto replikacijas
iniciacijas punktu.
Ja krustojas F un F šunas, griezuma rezultata
radies DNS pavediena 5 gals sak attities un
ieklust Fšuna.
Ja krustojas F un F šunas, griezuma rezultata
radies DNS pavediena 5 gals sak attities un
ieklust Fšuna.
20
Tas, ka F šunas pariet tikai viens F faktora
pavediens, ir pieradits, izmantojot ta saucamas E
.coli minišunas.
Šai bakterijai ir F- celmi, kas liela daudzuma
veido abortivas šunas, kuram nav nukleoida un
kuru izmers ir 10 no normala šunu izmera.
Minišunas
Tas ir minišunas, kas nespej replicet DNS.
Pec konjugacijas ar F šunam no minišunam tika
izdalitas F faktora DNS vienpavediena kopijas.
21
Ja F faktors integrets hromosoma, tad F faktora
DNS vienpavediena parravums inicie ta replikaciju
pec rotejoša gredzena mehanisma un hromosomas
vienpavediena kopijas nodošanu recipienta šunai.
Ari tas tika paradits ar minišunu palidzibu.
(P.J.Russel, 1994)
22
Tadejadi, konjugacija dala F faktora tiek nodota
kopa ar pirmajiem markieriem,
bet dala - ar pašiem pedejiem, kas notiek loti
reti konjugacijas kompleksa sadališanas del.
23
F plazmida bakterijas hromosoma var but integreta
dažados lokusos un dažadi orienteta.
Tapec bakterijas geni, kurus recipienta šuna
ievada pirmos, dažados Hfr celmos ir atškirigi.
Nemainas genu izvietojuma seciba.
24
Starp parnesto E.coli hromosomas dalu un
bakterijas recipienta hromosomu rec sistemas
proteinu klatbutne notiek homologiska
rekombinacija.
25
thr , leu, gal, lac, ton r, azi r , str s
.
HCfr donors
F- celms
thr - , leu-, gal-, lac-, ton s , azi s , str r .
26
Tulit pec abu celmu bakteriju kulturu
samaisišanas sakas konjugacija.
Regulari, ik pec dažam minutem, nem kulturas
paraugus un konjugaciju partrauc.
Visa bakteriala hromosoma tiek parnesta 100
minutes.
27
Kulturu izsej uz cietas selektivas barotnes
str , thr -, leu -
Jo jau iepriekš bija zinams, ka E.coli Hfr
konjugacijas pirmajas minutes parnes leu un thr
iezimetajgenus.
28
Savaktajos paraugos regulari nosaka, kada laika
seciba augošajas recipientšunas paradas parejie
analizejamie iezimetajgenu produkti.
Jo talak no F plazmidas integracijas vietas
atrodas iezimetajgens, jo mazaks eksperimenta
beigas ir ta rekombinantu skaits.
Tadejadi, izmantojot partraukto konjugaciju, var
noteikt genu secibu un to relativo attalumu
minutes.
29
Dažado Hfr celmu partrauktas konjugacijas analize
paradija, ka katram Hfr celmam raksturiga sava
genu parneses seciba.
Dažados Hfr celmos noslegta cirkulara saistito
genu grupa var parrauties dažadas vietas un var
tikt parnesta vai ar vienu vai ar otru galu
atkariba no Hfr celma.
F faktori ir novietoti uz migrejošas hromosomas
distala gala.
30
,
Seksdukcija
F
un
F plazmidas kopa ar F plazmidas DNS satur ari
bakterijas hromosomas fragmentu, kura garums
nereti ieverojami parsniedz plazmidas garumu (pat
lidz 50 no bakterijas hromosomas ).
31
Tas veidojas homologiskas rekombinacijas cela
starp identiskam F plazmidas integracijas vietam
(IS-elementiem ).Konjugejot ar F bakteriju, F
parnes bakterijas genoma dalu.
( P.J.Russel, 1994 )
32
Seksdukcija
- ta ir genu parnešana ar dzimumfaktoru F
palidzibu.
Krustojot F- x F, atškiriba no hromosomu genu
parneses, seksdukcija notiek ar augstu biežumu un
pirmajas minutes pec konjugacijas.
33
Piemeram
F- ( lac ) x F Lac ( Lac ) ? F Lac ( lac )
Iekavas noraditi hromosomu geni.
Šaja krustošana notiek F Lac ieklušana F-
šunas, kas izraisa speju izmantot laktozi.
Gens Lac/lac ir heterozigota stavokli
Lac alele saistita ar F faktoru, bet lac alele
saistita ar bakterialo hromosomu.
34
Genetiskaja analize seksdukcijas paradiba izraisa
sevišku interesi sakara ar iespeju iegut
bakterijam daleju heterozigotu, ko var izmantot
dominešanas petišanai.
35
Transformacija
Transformacija ir iespejama veselai rindai
bakteriju Diplococcus, Hemophilus, Neisseria,
Bacillus, ka ari aktinomicetem, cianobakterijam
u.c.
Tai ir kopigas likumsakaribas.
Vislabak ta ir izpetita tadam bakterijam ka D.
pneumoniae, B. subtilis, H. enfluenzae.
36
Musdienas ir visparzinams, ka dezoksiribonukleinsk
abe (DNS) ir visu prokariotu un eikariotu
iedzimtibas nesejs. Pirmoreiz tas tika paradits
eksperimentos ar pneimokokiem (F.Grifits,1928 ).
Ša mikroorganisma daži celmi izsauc plaušu
karsoni ziditajiem.
Bakterijas patogenie celmi sinteze polisaharozes
kapsulu, kuras glotaina virsma aizsarga
bakterialo šunu no inficeta dzivnieka imunas
sistemas fagocitiem.
37
Pneimokoku celmus citu no cita var atškirt pec
antivielam, ko produce dzivnieki ka atbildes
reakcija uz attiecigo celmu dažado polisaharidu
un olbaltumvielu ieklušanu vinu organisma.
Tieši pec antivielam uz kapsulu polisaharidiem
izškir dažadus patogenos celmus, kurus apzime
ka tips I, tips II, tips III, utt.
38
Patogenie celmi, kurus izaudze laboratorijas uz
cietas barotnes, veido spidigas gludas kolonijas,
tada morfologija kolonijam ir tadel, ka
bakterijas sinteze glotainu apvalku.
Reizem rodas tadas mutantas šunas, kas ir
zaudejušas fermentativo aktivitati, lai sintezetu
glotu apvalku.
. Šis mutantu šunas veido kolonijas ar grumbainu
virsmu. Tas atškiriba no vecaku šunam, kuras
apzime ar S burtu, apzime ar R burtu. (Apzimejumi
radušies no anglu valodas S -smooth gluds un
R rough grumbulains).
39
R-celmi vairojas tikpat labi ka S-celmi, pie tam
reizem rodas atgriezeniskas mutacijas, ka
rezultata atjaunojas speja sintezet glotapvalku.
Kapsularais polisaharidu tips, ko sinteze
revertanti, vienmer sakrit ar sakotnejo vecaku
celma polisaharidu tipu IIS?IIR, IIIS?IIIR utt.
Respektivi, katram R-celmam atbilst vecaku
S-celms.
40
R-celmu bakterijas ir nepatogenas.
Ja šadas šunas ieklust dzivnieku organisma,
piemeram, pelu, tad tada pele parasti parcieš
infekciju, izstradajot antivielas, kas noved pie
bakterialo šunu fagocitozes un to bojaejas.
Bet pele, kas inficeta ar S-celma bakterijam,
neizbegami iet boja no plaušu karsona, jo šis
bakterijas ir parklatas ar glotu apvalku.
41
1928. gada Frederiks Grifits paradija, ja pelem
ievadija IIR celma pneimokoku kopa ar karstuma
nonavetam IIIS tipa šunam, tad peles gaja boja no
infekcijas, ko, ka noskaidroja sekcija, izraisija
IIIS tipa šunas.
Kontroles eksperimenti radija, ka atseviški ne
IIR tipa šunu injekcija, ne IIIS tipa šunas , kas
nonavetas karsejot, nenoved pie pelu bojaejas.Tas
fakts, ka infekciju izraisošas šunas sintezeja
III tipa glotapvalku, bet ne II tipa, liecina par
to, ka šis šunas nevareja rasties atgriezeniskas
mutacijas rezultata celma IIR šunas (IIR?IIS).
42
Grifits nonaca pie secinajuma, ka nepatogenas IIR
celma šunas var transformeties par patogenam
IIIS celma šunam.
Bija paradits, ka pie 65?C temperaturas jau
izbeidzas fermentativa aktivitate, bet vel ir
saglabajusies transformejoša faktora aktivitate.
43
( Tortora G.J. Et al., 1992 )
44
Velak citi zinatnieki atklaja, ka nepatogeno
pneimokoku celmu transformacija par patogeniem
var notikt ari laboratorijas šunu kultura.
Pa retam radušas transformejušas šunas var viegli
atdalit no netransformejušam, jo tas neaglutine
serums, kas satur antivielas pret IIR tipa šunam.
Aglutinetas IIR šunas parslveidigi nosežas trauka
dibena , kamer transformejušas šunas nesalip, bet
brivi vairojas, veidojot dulkainu IIIS šunu
suspensiju. Šadas transformejošo šunu izdališanas
metodes in vitro uzlabošana deva iespeju izpetit
karstuma nonavetu IIIS šunu tranformejoša faktora
dabu nepastarpinati, neievadot tas peles un
negaidot to bojaeju.
45
1944. gada Osvalds Everijs, Kolins Makleods un
Maklins Makartijs paradija, ka transformacijas
aktivais agents ir kimiska tira DNS.
Musdienas pieradits, ka bakteriju šunas var
transformet bez hromosomalas DNS, ar plazmidu DNS
un fagu DNS (transdukcija), pie tam
transformacijas metodes saglabajas un mainas
tikai DNS izdališanas metode.
46
Pie transformejamam bakterijam pieder
Streptococcus pneumonia (ASV šo sugu sauc
Diplococcus pneumoniae),
Bacillus subtilis,
Haemophilus influenza.
Neskatoties uz to, ka optimalos apstaklos var
transformet ieverojami vairak pirmo divu sugu
šunas, macibu merkiem un transformacijas
mehanismu izpetei plaši izmanto B.subtilis, jo ši
nujina spej augt uz minimalam barotnem.
47
Transformacija iespejama ari citiem
mikroorganismiem,piemeram, E. coli, bet ta prasa
papildus metodes uzsildišana atdzesešana, šunu
turešana 0,1M CaCl2 utt.
48
Transformacijas procesu var iedalit 4 stadijas
1.Šuna adsorbe DNS. Šaja laika to var atdalit
šunu apmazgašanas cela, ka ari inaktivet,
pievienojot kulturai
dezoksiribonukleazi (Dnaze). Bac. subtilis 2,5
min. (1 markieris), H.influenzae 4-5 sek.
( Tortora G.J.et al. 1992.)
49
2.DNS uznemšana šuna. DNS neatgriezeniski
saistas ar šunu, nejutiga pret Dnazi.
50
3.Eklipses periods.
. Periods, kas iestajas pec DNS uznemšanas šuna
un ilgst lidz tas integracijai ar šunas
recipienta genomu. (Šaja perioda donoru markieru
aktivitate neparadas.)
51
4.DNS integracija
5.Transformantu ekspresija.
52
Kompetence
Šunas, kas spejigas uznemt DNS, sauc par
kompetentam. Kompetences ipatniba ir ta, ka ta
paradas tikai noteikta šunas dališanas perioda
(kulturas augšanas specifiskas stadijas).
53
Pie pneimokoku un Hemophilus transformacijas var
atrast tadus apstaklus, pie kuriem vairums šunu
ir kompetentas, ko spriež pec DNS adsorbcijas.
B.subtilis populacija pec kompetences ir
heterogena apmeram par 10.
Kompetence var saglabaties, glabajot šunas -20?C
10 glicerina.
54
Sakuma arpusšunas kompetences faktors tika
atklats streptokokiem.
Apstradajot šunas, kuras pims tam
netransformejas, ar šo faktoru, tam paradijas
speja uznemt DNS. Pec šo autoru zinam kompetences
faktoram piemit mazmolekularas olbaltumvielas
ipašibas.
55
Ir atrasti dažadi mutanti, kas ir defektivi pec
kompetences.
Kompetentam šunam izmainas šunapvalks. Apvalks
klust porainaks, membrana uz šunas iekšpusi
veidojas izvirzijumi.
56
Transformacijas izmantošana hibridiologiskaja
analize.
Pie DNS izdališanas gredzenveida molekula (viena
kedes grupa) sadalas 25 fragmentos atseviškas
molekulas.
DNS segmenti satur apmeram 10-20 genus.
57
Pie tam genetiskie determinanti, kas novietoti
bakterialas hromosomas dažadas vietas, atdalas un
transformacijas procesa tiek nodoti neatkarigi.
Var but divu genu nodošanas gadijumi saistita
transformacija.
58
Saistibas kriterijs
Saistibas kriterijs DNS atškaidišanas efekts.
Dažadas koncentracijas robežas transformantu
biežums lineari samazinas lidz ar DNS
koncentracijas samazinašanos.
59
Ja 2 geni tik tiešam ir novietojušies viena
molekula, tad divkaršo transformantu biežuma
izmainu grafiks ies paraleli parastajai
transformacijai.
Ja divkaršie transformanti rodas, pateicoties
vairaku DNS molekulu ieklušanai atseviškas šunas,
tad to skaits ieverojami vairak samazinasies pie
DNS atškaidijuma. Skaitliski saistibas speks tiek
raksturots ar kotransformacijas indeksu
(vienlaicigas parneses indekss r)
60
A ------------- x a AB------------ x ab
recipients
donors
Ab
vienkaršie transformanti
AB divkaršs transformants
aB

• Divkaršo transformantu skaitu nosaka uz minimalas
  barotnes
• A-uz min. bar.?B,
• B uz min. bar.?A.

61
Saistitas transformacijas izpete dod iespeju
kartet cieši saistitus genus un noteikt gena
izmeru.
62
Pie galvenajam pazimem, kuras transformetas
dažadu sugu bakterijas ar DNS palidzibu, pieder

• kapsulu un virsmas-somatiskie antigeni

• rezistence pret antibiotikam

• rezistence pret sulfanilamidiem un aminopterinu

• speja sintezet dažadus aminoskabes un citus
  augšanas faktorus

• speja izmantot oglhidratus.

63
Transformacijas mehanisms
Driz pec pievienošanas, pirms ieklušanas šuna,
viena no tranformejamam DNS kedem tiek sagriezta
ar endonukleazi, kas atrodas periplazmatiskaja
telpa starp sienu un membranu.
64
Pec tam ši vai ari cita endonukleaze pievienojas
pie komplementara nebojata pavediena un taisa
taja vairakus griezumus. Rezultata veidojas
transformejamas DNS divpavedienu fragmenti.
( Russell P.J., 1998 )
65
Talak šie fragmenti paklaujas eksonukleažu
darbibai, kas noved pie pilnigas DNS vienas kedes
degradacijas un vienpavedienu fragmentu
veidošanas.Šada forma transformejama DNS ieklust
šunas iekšiene.
66
Tiek pienemts, vismaz attieciba uz pneimokokiem,
ka ši pati eksonukleaze palidz ievilkt šuna
vienpavediena donora DNS uz tas energijas
rekina, kas atbrivojas degradejoties
komplementarai kedei.
67
Pirmas tris transformacijas stadijas DNS
pievienošana, tas adsorbcija un vienas kedes
degradacija notiek ar vienadu efektivitati
neatkarigi no tas homologijas ar recipienta DNS.
68
Tomer DNS integracijas vai rekombinacijas
process ir specifisks attieciba uz homologisko
DNS un ar nehomologisko DNS notiek ar loti zemu
biežumu.
69
Transdukcija
Specializeta transdukcija
Vispariga transdukcija
Pilna transdukcija
Abortiva transdukcija
70
Vispariga transdukcija
1951. gada N. Cinders un Dž. Lederbergs, petot
salmonellas bakteriofaga P22 replikaciju,
atklaja, ka faga morfogenezes laika DNS
iepakošana kapsida ne vienmer ir specifiska.
Faga populacija ar biežumu 10 -4 10-5 atrada
dalinas, kas vai nu kopa ar fagu DNS satur ari
bakterijas hromosomas fragmentu vai ari satur
tikai dalu no bakterijas hromosomas.
71
Šadi fagi ir defektivi.
Tie var inficet bakteriju un ievadit taja DNS.
Bet faga replikacija nenotiek, jo ir zaudeta dala
no faga linearas divpavediena DNS genoma.
72
Transduceties var jebkurš no bakterijas geniem.
DNS daudzums, ko no donora uz recipientu var
maksimali parnest, atbilst faga genoma lielumam.
McKane L. Un J.Kandel, 1996
73
Bateriofagam P22 genoma lielums ir apmeram 90 000
bp,
tatad apmeram 100 bakterijas geni.
Transducejošie fagi
Salmonella typhimurium
P22
E. coli
P1
PSB1
SP10
Bacillus subtilis
74
Visparigo transdukcij izmanto ka vienu no
precizakajam genu genetiskas kartešanas metodem.
Genu kartešanai izmanto pazimju vienlaicigo
transdukciju (kotransdukciju ),t. i., nosaka, ar
kadu biežumu bakteriofags vienlaicigi parnes divu
iezimetajgenu parus
75
Genu parnese visparigaja transdukcija var
izraisit divus dažadus transduktantu stavoklus.

• Viena gadijuma gens parmantojas stabili, par cik
  tas integrejas ar recipienta hromosomu. Ta ir
  pilna transdukcija.

76

• Citos gadijumos pie abortivas transdukcijas
• ar fagu parnestais genoma fragments nereplicejas
  un,

transduktantam vairojoties, parmantojas pa vienu
liniju, t.i. no divam pecnaceju šunam pie katras
dališanas , tikai viena iegust transduceto genu.
77
Ta daleji var transducet genu, kas nosaka vicinas
klatbutni S. typhimuricum.
Šai gadijuma visa klona transduktantu paaudze-
vicina, tatad kustigumu saglaba tikai viena
šuna.
Abortiva transdukcija notiek biežak ka pilna,
reizem pat 10 reizes.
78
Specializeta transdukcija
1956.gada Dž. Un E. Ledenbergi atklaja otru,
ierobežotas jeb specializetas transdukcijas veidu.
79
Specifiska ( specializeta ) transdukcija no
nespecifiskas atškiras ar to, ka bakteriofags
var parnest tikai noteiktus genus, ka tas ir
raksturigs E.coli fagam ?, kas var transducet
tikai lokusu gal genus, kuri ir atbildigi par
galaktozes izmantošanu, un bio - biotina sintezes
genus.
Bakteriofags ? pie E.coli lizogenizacijas
integrejas tas hromosoma, vieta starp gal un bio
lokusiem. Tas tika paradits konjugativi krustojot
lizogenas Hfr un nelizogenas F- bakterijas.
Defektiviem ? gal fagiem 1/4 lidz 1/3 paša genoma
samainits uz gal - bakterijas hromosomas
iecirkni.
80
(No Transcript)