T Berdous

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Polymorphismes génétiques des anti-cancéreux

• T Berdous
• INSERM U716 Pr F Calvo
• Direction S Mourah

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PHARMACOGENETIQUE

• Variabilité interindividuelle de la réponse à un
  médicament
• Objectifs gt Améliorer la maîtrise de la
  variabilité interindividuelle
• Individualiser le traitement médicamenteux
  choix de
• la molécule mais
  aussi posologie et rythme
• dadministration

Le bon traitement, à la bonne personne et, au
bon moment
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Polymorphismes génétiques

• Définition
• Modification de séquence, stable, observée chez
  plus d1 de la population
• -Répétitions en tandem microsatellites/minisatel
  lite
• -La plus simple se situe au niveau d'un
  nucléotide Single Nucleotide
• Polymorphism ou SNP
• Le génome humain 107 de SNP / 3 milliards pb
  contribuant à la diversité de
• l'espèce
  humaine
• Variations nucléotidiques conséquences
• séquence acide aminé
• l'expression
• in fine l'activité
• Certains polymorphismes sont non fonctionnels ou
  silencieux, conservation
• structure et/ou fonction.

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Conséquences cliniques des différents
phénotypesmétaboliques pour un médicament à
indexthérapeutique étroit anticancéreux

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Anticancéreux
La classification des agents anticancéreux se
fait suivant leur mécanisme d'action sur le cycle
cellulaire et leur appartenance à des familles
chimiques.Médicaments altérant l'ADN -
agents intercalants daunorubicine ,
anthracyclines (la pluplart sont des
antibiotiques)- inhibiteurs de la topoisomérase
I et II irinotécan, étoposide
Inhibiteurs enzymatiques - de la dihydrofolate
réductase méthotréxate Antimétabolites -
5-fluoro-uracile Cytokines - interféron
alphaAltération du fuseau mitotique
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Métabolisme et transport des Xénobiotiques
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Objectif

• Mise au point et validation dune méthode de
  détection des polymorphismes des
• gènes MDR1 et UGT1A1, basée sur la technologie de
  PCR à sonde dhybridation
• ? Polymorphismes des exons 26 et 21du gène MDR1
  transport des
• Anthracyclines et de lAracytine
• ? Polymorphismes de la TATA Box du gène UGT1A1
  toxicité à lIrinotécan
• ? Association des SNP avec lexpression génique

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MDR1 - P-gp - gp170
P-gp Function

• transporteur le mieux caractérisé de la famille
  des ATP Binding Casette protéines
• responsable de lefflux cellulaire
  danticancéreux (Anthracyclines)
• surexprimé (ARN et protéine) dans les cellules
  cancéreuses

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• ? 28 polymorphismes décrits (1236, 2677, 3435)
• ? Le SNP 3435CgtT sur lexon 26 définit 3
  génotypes CC, CT et TT
• ? Fonctionnalité de la Pgp dans les cellules
  hématopoïétiques moins élevée avec le génotype TT
  par rapport au CC (Hoffmeyer 2000) mais linverse
  est trouvé par dautres (Kim 2002)
• ?La fréquence de la mutation CgtT varie selon les
  races génotype CC plus fréquent chez les
  africains et les afro-américains (83 et 61) par
  rapport aux caucasiens (26) et aux japonais ou
  chinois (34) (Schaeffeler 2001) 83-84 versus
  48 et 53 (Ameway 2001)

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• Polymorphisme du gène UGT1A1 en réponse à
  lirinotécan
• Uridine diphosphate Glucuronyl Transférase
  enzyme membranaire
• Enzyme de phase II, catalyse la
  glucuronoconjugaison.

? polymorphisme de répétition dans la TATA box du
promoteur ( délétion ou insertion de séquence TA)
plusieurs allèles (TA)5, (TA)7, (TA)8
(phénotype sauvage (TA)6). ?TA7 est associée à
létat homozygote, à la maladie de Gilbert
(Kadakol 2000). ? déficit en UGT1A1 est à
lorigine dune toxicité sévère (diarrhée,
leucopénie) dans le traitement de certains
cancers par lirinotécan
structure du gène UGT1A1
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Patients Méthodes

• - 9 patients atteints de Leucémie aigue
  myéloblastique et 20 donneurs sains ont été
  inclus
• - les PBMC ont été isolées (Ficoll)
• - les ADN et ARN des PBMC ont été extraits sur
  colonnes Qiagen
• - détection des SNP 3435 CgtT (exon 26) et 2677
  CgtA (exon 21) du
• gène MDR1 et de UGT1A1 en utilisant la
  technologie des sondes à
• hybridation (Roche)
• - quantification des transcrits MDR1 par RT-PCR
  quantitative en utilisant
• la technologie des sondes à hydrolyse (TaqMan)

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Méthodes

• Technologie SybrGreen
• Sondes à Hybridation

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Résultats - MDR1
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Polymorphisme MDR1 / 3435 CgtT
Tm nt 3435 Wt 56C Mut 64C
PCR en Sonde à hybridation
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Polymorphisme MDR1 / C3435T
Répartition des génotypages MDR1 (n9) CC
CT TT (2/9)
(5/9) (2/9)
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Polymorphisme MDR1 / C2677A

• Homozygote sauvage 2677
• Pas de mutation

Tm 59C
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Quantification des transcrits MDR1 et SNP
Identification échantillon Génotype Tanscrits MDR1 (copies/106 copies b2m)
C42 3435CT / Hétérozygote 2115
C77 3435CT / Hétérozygote 250
C112 3435CT / Hétérozygote 200
C114 3435CT / Hétérozygote 300
C100 3435CT / Hétérozygote 11
C73 3435CC / Homozygote sauvage 1536
C16 3435CC / Homozygote sauvage 4
C71 3435TT / Homozygote muté 643
C121 3435TT / Homozygote muté 39

• ? 2 donneurs sains homozygotes sauvages
• ? Moyenne dexpression des transcrits MDR1 21.3
  et 566 copies de MDR1/106 copies b2m
  respectivement dans les 2 groupes (20 donneurs
  sains et 9 LAM).
• ? Association C3435T Hétérozygote et
  surexpression de MDR1 (4/5)

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Résultats UGT1A1 sonde TA7
Tm 40C 46C
40C
Répartition des génotypages UGT1A1 (n6)
TA6/TA7
TA6/TA6
(4/6)

(2/6)
Selon la méthodologie décrite par Von Ahsen en
2000
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Discussion

• Identification fiable et reproductible des
  différents polymorphismes MDR1 et UGT1A1 étudiés
• MDR1
• C3435T
• Détection de différents profils dans les LAM
  (hétérozygotes, homozygote muté/sauvage),
• Donneurs sains homozygotes sauvages 3435CC
• C2677A
• un seul génotype homozygote sauvage
• Ces fréquences sont en accord avec celles
  rapportées par dautres équipes.
• La mutation C2677A est décrite comme rare
  (Hoffmeyer et al 2003)

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Discussion

• Association SNP et expression de MDR1
• - Illmer et al 2002,
• association phénotype-génotype des
  polymorphismes MDR1 (n 405 patients)
  C3435T, C2677A C1236T
• - Association C3435T
• Hétérozygote et surexpression de MDR1 (4/5)

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• UGT1A1
• Sonde TA7, caractérisation de 2 profils
  génotypiques
• - homozygote sauvage TA6/TA6
• - hétérozygote muté TA6/TA7
• - les autres génotypes non mis en évidence
• groupe restreint
• Le génotypage de ces polymorphismes est
  réalisable avec les sondes TA6, TA8 (validation
  des résultats).
• Optimisation de la méthode décrite par Von Ahsen
  et al
• Détection des différents génotypes en
  utilisant une seule sonde
• TA7

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Conclusion Perspectives

• ? Mise au point et validation de la détection des
  SNP C3435T, C2677A
• (MDR1) et polymorphismes UGT1A1 par sonde à
  hybridation
• ? Méthode reproductible et fiable, spécifique et
  sensible (picogrammes dADN)
• ? Evaluer les conséquences cliniques et
  thérapeutiques de ces SNP
• ? Association phénotype-génotype

Mise à disposition du médecin de tests de
dépistage de polymorphismes génétiques,
réalisables en routine, permettant de prédire
lefficacité ou la toxicité dun traitement pour
un individu donné.
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Sonde Génotype Tm par
Tm
PCR Thermodynamie

• UGT1A1 TA5
  35,4C 36,3C
• TA6
  39,9C 39C
• TA7
  46,2C 46,4C
• TA8
  42,2C 41,3C

Nos résultats sont en accord avec ceux décrits
par Von Ahsen en 2000
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Mécanismes moléculaires à lorigine dune
anomalie du métabolisme