VALIDACI

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• VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS
• Prof. Dr. Luis Salazar N.
• Depto. de Ciencias Básicas UFRO
• 2004

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Qué características tengo que considerar cuando
selecciono un método para incorporarlo a la
rutina del laboratorio?
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• Se debe considerar
• Uso que se le dará (rutina, confirmatorio)
• Nº de tests a realizar
• Instrumentación requerida
• Sensibilidad, especificidad, exactitud y
  precisión
• Costo
• Tipo de muestra
• Tipo de analito
• Seguridad
• Aceptación internacional y científica
• Que no sea obsoleto

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Fases que debe pasar un kit antes de poder ser
comercializado o empleado en el laboratorio
DISEÑO Y OPTIMIZACIÓN DEL ENSAYO
VALIDACIÓN ANALÍTICA
VALIDACIÓN CLÍNICA
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Cuándo es necesario validar?

• Cuando se está desarrollando una técnica nueva.
• Antes de incorporar una nueva técnica a la rutina
  del laboratorio.
• Cuando se desea comparar el desempeño de dos
  técnicas.

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VALIDACIÓN

• La validación de un método analítico es un
  proceso de evaluación sistemático para demostrar
  que el método cumple con los requisitos
  necesarios para el uso que se le va a dar.

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QUÉ ES LA VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO?

1. Validación es la confirmación mediante examen y
   aporte de evidencia objetiva de que se cumplen
   los requisitos particulares para el uso
   específico previsto (ISO 8402, ISO 17025).
2. La validación debe ser tan exhaustiva como sea
   necesario para responder a las necesidades de la
   aplicación en cuestión.
3. La validación puede incluir procedimientos para
   el muestreo, manejo y transporte de muestras.

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VALIDACIÓN ANALÍTICA

• Estudia los parámetros de desempeño analítico del
  método
• Precisión
• Exactitud
• Especificidad
• Límite de detección
• Límite de cuantificación
• Linealidad e intervalo de linealidad
• Robustez

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• Validación Metodológica
• Espectro de absorción
• Estabilidad de la reacción de color
• Linealidad
• Límite de dilución
• Recuperabilidad
• Sensibilidad
• Límite de detección
• Validación Estadística
• Precisión
• Exactitud

VALIDACIÓN ANALÍTICA
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VALIDACIÓN METODOLÓGICA
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LINEALIDAD

• Es la capacidad de producir resultados
  proporcionales a la concentración del analito en
  las muestras dentro de un rango determinado de
  concentración ya sea directamente o por medio de
  una transformación matemática bien conocida.
• Se analizan muestras de concentraciones conocidas
  o series de muestras diluidas en al menos 5
  niveles de concentración.
• Repetir 3 veces en forma independiente
• Se grafican los datos resultantes en el eje y y
  los valores conocidos o esperados en el x.

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INTERVALO DE LINEALIDAD Y LÍMITE DE DILUCIÓN
Rango de Linealidad 0 10 g/dL Límite de
Dilución 10 g/dL
2 4 6 8 10
12 g/dL
Rango de linealidad intervalo entre las
concentraciones más baja y más alta de analito
determinadas, para las cuales se cumple la ley de
Beer.
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Curvas de calibración
14
Errores de una calibración inadecuada
15
DESVIACIONES DE LA LEY DE BEER RADIACIÓN
POLICROMÁTICA
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RECUPERABILIDAD
Capacidad de un método de determinar todo el
analito presente en la muestra, según el alcance
del método (algunos solo determinan algunas
especies del analito). La mejor manera de
determinar la eficacia de extracción del método
es adicionar diferentes concentraciones del
analito a las muestras y procesarlas por el
método completo.
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Aunque es la manera más común de cuantificar la
recuperación, el analito adicionado puede no
enlazarse tan fuertemente a la matriz como el
presente de manera natural y dar como resultado
la impresión de una elevada eficacia de
extracción. La alternativa es efectuar el
proceso con MR en la matriz deseada, si existen
si estos MR han sido generados mediante
caracterización de muestras naturales el estudio
de recuperación representará con mayor precisión
la extracción de muestras reales.
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ENSAYO DE RECUPERACIÓN

• También llamado de adición estándar.
• Se puede llevar a cabo de dos maneras con
  placebo o con muestra, que se enriquece con
  estándar.
• Realizar las medidas por triplicado.

Criterio de Aceptación de recuperación
obtenido entre 85 - 115
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SENSIBILIDAD

• La sensibilidad se refiere a la respuesta
  obtenida para una determinada cantidad de
  analito.
• También se indica mediante dos factores
  analíticos
• El Límite de Detección (LOD).
• El Límite de Cuantificación (LOQ).

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LÍMITE DE DETECCIÓN (LOD)

• Es la concentración más baja del analito que se
  puede detectar pero no necesariamente
  cuantificar.
• En general, es el punto al que la señal del
  analito es igual a tres veces el ruido de la
  medida.
• Para algunos espectrofotómetros se puede
  establecer que el LOD es, aproximadamente, tres
  veces la desviación estándar.

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LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LOQ)

• El LOQ es la concentración más baja del analito
  que se puede determinar con una precisión y
  exactitud aceptables.
• Para calcular el LOQ se deben de definir por
  tanto los límites aceptables de precisión y
  exactitud.
• Se puede aproximar a la relación entre la
  precisión de la medida analítica y la
  sensibilidad del método.

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ROBUSTEZ

• Es una medida de la capacidad de un procedimiento
  de permanecer inalterado por pequeñas pero
  deliberadas variaciones en los parámetros del
  método y provee información de su comportamiento
  en la rutina.
• Parámetros estudiados
• Efectos del congelado- descongelado
• Tiempos de incubación
• Temperaturas de incubación
• Longevidad de los reactivos
• Preparación de la muestra
• Conservación de la muestra

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ESPECIFICIDAD

• Habilidad de evaluar inequívocamente el analito
  en presencia de componentes que se puede esperar
  que estén presentes.

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INTERFERENCIAS

• Efecto de una sustancia presente en una muestra
  que causa que el resultado de un test sea
  erróneo.
• Puede ser dependiente del analito o independiente
  del mismo y puede aumentar o disminuir la medida
  realizada.
• Son difíciles de detectar.
•  

25
COMO DETECTAR Y CHEQUEAR INTERFERENCIAS

• Son difíciles de detectar pues se desconoce el
  resultado verdadero. Se saca de los datos del
  fabricante o de literatura.
• Prestar atención a resultados de pacientes con
  condiciones clínicas asociadas con interferencias
  (enfermedades hepáticas, fallas renales,
  embarazo).
• Incongruencias con cuadro clínico.
• Inspeccionar las muestras visualmente buscando
  hemólisis, ictericia, lipemia o mejor evaluarlas
  usando índices séricos.

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FORMAS DE ESTUDIAR LAS INTERFERENCIAS

• Test de dilución lineal (las interferencias no se
  comportan linealmente con la dilución).
• Analizar la muestra por otro método (se comportan
  diferentes).
• Tratar la muestra para remover, destruir o
  inhibir sustancias potencialmente interferentes.
• Análisis de muestras enriquecidas con el
  interferente.

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Análisis de muestras enriquecidas

• Se prepara una muestra agregando el material
  interferente a una muestra real que contenga el
  analito.
• Una segunda alícuota de la muestra original se
  diluye con un solvente y ambas se analizan
  determinándose la diferencia entre ambas.

28
VALIDACIÓN ESTADÍSTICA
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PRECISIÓN

• Expresa el grado de acuerdo entre valores cuando
  se analiza la misma muestra estable
  repetidamente. Se habla de Imprecisión.
• Puede considerarse a tres niveles
• Repetibilidad
• Precisión intermedia
• Reproducibilidad

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• REPETIBILIDAD (REPETITIVIDAD) Precisión obtenida
  bajo las mismas condiciones de operación en un
  intervalo corto de tiempo (mismo día), por un
  mismo analista, en la misma muestra homogénea y
  en el mismo equipo.
• PRECISION INTERMEDIA Precisión obtenida dentro
  del laboratorio por diferentes analistas,
  diferentes equipos, días distintos con la misma
  muestra homogénea.
• REPRODUCIBILIDAD Expresa la precisión entre
  laboratorios como resultado de estudios
  interlaboratoriales diseñados para estandarizar
  la metodología.

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1. Se estudia mediante experimentos de replicación.
2. El propósito es observar la variación esperada en
   el resultado de un test bajo las condiciones de
   operación normal de un laboratorio.
3. Estima el error causado por factores como el
   pipeteo, condiciones de reacción (Tº, mezclado).
4. Suele ser mayor en sistemas no automatizados.

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• Las muestras de ensayo comúnmente usadas son
  soluciones estándar, materiales de control,
  pooles de pacientes o muestras frescas de
  pacientes individuales.
• Se emplean los resultados de 20 alícuotas de
  cada material y se calcula la media, el desvío
  estándar y el coeficiente de variación.
• Período de tiempo que abarca el experimento
  Tiempo ideal 20 días.

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CÁLCULOS
Promedio
Desvío standard
Coeficiente de variación
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EXACTITUD

• Expresa la cercanía entre el valor que es
  aceptado, sea como un valor convencional
  verdadero (material de referencia interno), sea
  como un valor de referencia (material de
  referencia certificado o estándar) y el valor
  promedio obtenido al aplicar el procedimiento de
  análisis un cierto número de veces.
• Un test exacto es implicitamente específico y
  preciso

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Cómo la determino?

• A) Comparación con métodos de referencia.
• B) Análisis de muestras de referencia
  certificadas.
• C) Ensayos de recuperación.
• D) Ensayos interlaboratorios.

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• Comparación con métodos de referencia
• Se analizan muestras de pacientes por el método
  en estudio y otro método de comparación, luego se
  estima el error sistemático basándose en las
  diferencias observadas para ambos métodos.
• El método de comparación debe en lo posible ser
  el de referencia (gold standard). Es una
  técnica cuyos resultados se han comparado con
  métodos definitivos y/o trazables a materiales
  estándar de referencia.

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• Número de muestras a usar
•  
• Mínimo de 40 para los dos test.
• Deben elegirse de modo de cubrir todo el rango
  de trabajo del método y representar el espectro
  de enfermedades esperadas en la aplicación de
  rutina del método.
• Es mejor realizar ensayos de las muestras por
  duplicado (a partir de dos alícuotas diferentes)
  en diferentes corridas o por lo menos en
  diferente orden.
• Período de tiempo
•  
• Mínimo de 5 días, lo ideal 20 días, corriendo 2
  a 5 muestras de pacientes por día.
•  

38

• Análisis de datos
•  
• Existe mucha discusión sobre cual es la mejor
  forma de analizar los datos
• A) Graficar los resultados y hacer una
  inspección visual de los mismos.
• Cualquier muestra con resultados discrepantes
  debe ser reanalizada.
• Para los métodos que se espera coincidan hacer
  primero un gráfico de diferencias. Las mismas
  deberán oscilar alrededor de la línea del cero.

39
(No Transcript)
40

• Cálculos estadísticos
•  
• Para la comparación de resultados que cubren un
  amplio rango analítico lo mejor es el cálculo de
  la regresión lineal.
• Permite estimar el error sistemático a más de una
  concentración de decisión médica.
• También se puede calcular el coeficiente de
  correlación r que permite saber si el rango de
  datos es lo suficientemente amplio para dar
  buenos estimados de la pendiente y la ordenada en
  el origen (r gt 0.99).

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B) Análisis de muestras de referencia certificadas

• Se analiza un mínimo de 3 concentraciones y 5
  determinaciones por el método a validar y se
  compara el resultado obtenido con el valor
  verdadero declarado.
• Criterio de aceptación
• El valor medio debe estar dentro del 15 del
  valor nominal excepto en el Límite de
  cuantificación (LDC) que puede ser el 20.

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VALIDACIÓN CLÍNICA
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Validación Clínica

• La toma de decisiones clínicas es un proceso
  extremadamente complejo en el que deberá
  finalmente ser valorada la utilidad de la prueba
  diagnóstica para el manejo del paciente.

Debo conocer la exactitud, es decir, su
capacidad para clasificar correctamente a los
pacientes en categorías o estados en relación con
la enfermedad (típicamente dos estar o no estar
enfermo, respuesta positiva o negativa a la
terapia).
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Diseño de los estudios de Validación clínica

• En el diseño debe considerarse
• Intervalos de referencia o rangos normales.
  Existe diferencia con la edad, sexo u otro
  factor? Pueden usarse valores de literatura?.
• Valores de cut off o umbral de decisión pueden
  usarse los generalmente aceptados?.

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Selección de las muestras

• Debe tomarse una porción que sea representativa
  de la población total.
• Idealmente deben elegirse los sujetos por un
  proceso al azar para evitar sesgos.

46
Análisis de las muestras

• Para evitar sesgos el ensayo debe hacerse a
  ciegas, es decir sin que el laboratorista sepa la
  condición clínica del paciente.
• Si se comparan varios test en el mismo estudio,
  deben hacerse todos los test en todos los sujetos
  y en el mismo punto del curso de su enfermedad.

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Evaluación del desempeño

• Sensibilidad
• Es la probabilidad de clasificar
  correctamente a un individuo cuyo estado real sea
  el definido como positivo respecto a la condición
  que estudia la prueba, razón por la que también
  es denominada fracción de verdaderos positivos
  (FVP).

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• Especificidad
• Es la probabilidad de clasificar
  correctamente a un individuo cuyo estado real sea
  el definido como negativo. Es igual al resultado
  de restar a uno la fracción de falsos positivos
  (FFP)

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• Prevalencia
• Indica la proporción de sujetos en la
  población estudiada que realmente tienen la
  enfermedad.

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• Un test perfecto tiene S y E de 100.
• En realidad existe un par S-E para cada umbral o
  nivel de decisión.
• Hay que decidir que par S-E funciona mejor para
  las circunstancias en que quiero usar el test.