Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico

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Trasformazione di cellule competenti con DNA
plasmidico
Metti il DNA e le cellule insieme
Fai qualcosa di speciale
Scatola nera
Poi succede qualcosa .
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Trasformazione battericaUptake of DNA nudo,
spesso un plasmide circolare
Cell wall
GFP
Bacterial chromosomal DNA
Beta lactamase (ampicillin resistance)
pGLO plasmids
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Metodi di trasformazione

• Elettroporazione
• shock elettrico che rende le membrane cellulari
  permeabili al DNA(si usa anche per le lellule
  eucariotiche)
• Calcio cloruro/Heat Shock
• Cellule, rese competenti chimicamente,
  incorporano DNA nudo dopo heat shock

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Ruolo del CaCl2 per rendere le cellule competenti

• CaCl2 genera buchi nella membrana dei batteri
  rendendoli capaci di incorporare DNA

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Ruolo del CaCl2 per rendere le cellule
competenti- cont

• Gli ioni of Ca2 carichi positivamente
  mascherano le cariche negative dei gruppi fosfato
  presenti nel DNA

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Attenzione!!!!

• CaCl2 rende le cellule più fragili
• Delicatezza (ghiaccio e pipettata gentile)

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Trasformazione di cellule competenti con DNA
plasmidico
Metti il DNA e le cellule insieme
45 minuti in ghiaccio
Il DNA aderisce ai batteri
Shock termico 42 C per 2 min
Il DNA entra nei batteri
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Trasformazione di cellule competenti con DNA
plasmidico - cont
Periodo di recupero a 37 C in presenza di
terreno che permette la replicazione del DNA
plasmidico nelle cellule in cui è entrato
1 ora a 37 C
Questo periodo permette alle cellule di esprimere
il gene di resistenza all antibiotico (ampicilli
na) e di potere replicare successivamente sulle
piastre
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Controlli della Trasformazione
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Spread plate
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Spread plate
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Spread plate

• Piastre rigorosamente asciutte
• MAI piastrare più di 300 µl o MENO di 50 µl
• Raffreddare bene la bacchetta di vetro
• Lasciare asciugare prima di spostare le piastre
• Le piastre danno conteggi affidabili solo se il
  numero di colonie é tra 30 e 500

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Finalmente.

• Se non avete la disponibilità di un incubatore a
  37 C potete lasciare le piastre sul banco.
  Vedrete le colonie dopo 2 3 giorni.

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EFFICIENZA DI TRASFORMAZIONEColony Forming Unit
(CFU)/µg DNA

• Calcolre i µg totali di DNA usati
• Calcolare il fattore di diluizione della
  piastratura (se é stata fatta)
• Contare le colonie
• Moltiplicare il numero di colonie per la
• diluizione di piastratura
• Dividere per i ng di DNA utilizzato
• Efficienza di trasformazione (CFU/?g) ncolonie
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  ??????????????????? ?g DNA